一种检测孔雀石绿的免疫层析试纸及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测孔雀石绿的免疫层析试纸及其制备方法。本发明提供的检测孔雀石绿的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的硝酸纤维素膜、连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有孔雀石绿抗原，所述质控线含有能与所述孔雀石绿抗体特异结合的抗抗体。本发明的实验证明，用本发明提供的试纸检测孔雀石绿，灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。

主权项

一种检测孔雀石绿的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有孔雀石绿抗原，所述质控线含有能与所述孔雀石绿抗体特异结合的抗抗体；所述超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体为孔雀石绿抗体和超顺磁性复合粒子的肽键共价结合形成的聚合体；所述孔雀石绿抗原为孔雀石绿半抗原与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白与孔雀石绿半抗原的偶联比为1:10；所述孔雀石绿抗体为孔雀石绿单克隆抗体；所述与所述孔雀石绿抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述孔雀石绿抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为1mg/ml；所述孔雀石绿半抗原为孔雀石绿；所述载体蛋白为BSA；所述超顺磁性复合粒子为Fe3O4纳米粒子；所述超顺磁性复合粒子的粒径为100nm；所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度为40emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒；所述超顺磁性复合粒子表面的羧基含量为80μmol/g；所述孔雀石绿抗体亲和常数为108M‑1；所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体按照如下方法制备：1）将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳二亚胺、1.15mg N‑羟基丁二酰亚胺和1ml浓度为0.1M、pH值为4.7的2‑(N‑吗啡啉）乙磺酸缓冲液混匀，反应，得到活化后磁性粒子；反应温度为37℃，反应时间为0.5h；2）将每2.5mg步骤1）得到活化后磁性粒子、0.15mg孔雀石绿抗体和0.8ml浓度为50mM pH为8.5的硼砂缓冲液混匀、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；反应温度为25℃，反应时间为3.5h；3）向步骤2）得到的反应液中加入BSA混匀得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；反应温度为37℃，反应时间为0.5h；所述BSA在所述混合液中的浓度为5%（质量百分含量）；所述孔雀石绿抗原按照如下方法制备：A）将每60ml无水乙醇、24g无水ZnCl2、5mg固体强酸离子交换树脂、0.9g4‑对羧基苯甲醛、2.4ml N,N‑二甲苯胺混匀，反应，得到反应液a；所述反应温度为85℃，所述反应时间为25h；B）冷却步骤A）得到的反应液a，在每62.4ml冷却后反应液a中加入2ml浓度 为1mol/L的盐酸、30ml无水甲醇，混匀至出现结晶，得到羧基化孔雀石绿；所述冷却的时间为12小时；C）将每82mg步骤B）得到的羧基化孔雀石绿溶解于8ml N,N‑二甲苯胺，再加入20.6mg N,N‑二环已基碳化二亚胺混合，再加入8.6mgN‑羟基丁二酰亚胺反应，得到活化的孔雀石绿；所述混合的温度为25℃，所述混合的时间为15min，所述反应为先在25℃下反应1h，再在4℃下反应1.5h；D）将每100mg载体蛋白溶解于8ml浓度为0.1mol/L、pH为8.5的硼酸钠溶液，得到载体蛋白硼酸溶液；E）将每82mg步骤C）得到的活化的孔雀石绿加入8ml步骤D）得到的载体蛋白硼酸溶液，反应，得到反应液b；将反应液b透析、冻干，得到孔雀石绿抗原；所述反应温度为4℃，所述反应时间为3.5h；所述超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体的制备方法中：在所述步骤3）后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬浮，得到超顺磁性复合粒子标记孔雀石绿抗体的步骤，所述洗涤液和悬浮液均为浓度为0.02M pH为7.4的PBS缓冲液。