一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法

摘要

本发明提供的是一种通过诱导南方红豆杉愈伤组织再分化来增强或保持其细胞代谢的遗传稳定性，提高其次生代谢产物紫杉醇含量的技术。包括外植体预处理、愈伤组织诱导培养、愈伤组织继代培养、愈伤组织再分化诱导培养4个步骤。诱导愈伤组织再分化是将继代培养4次，每次培养20～35天，颜色好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05～0.20mg/L6-BA、0.2～2.0mg/LNAA、0.1mg/LKT、0.5mg/LCH的改良MS培养基中进行再分化诱导培养，诱导培养45～75天后，南方红豆杉愈伤组织会长出微小芽体，此时收获愈伤组织，样品经干燥称重和一系列预处理后，用HPLC进行紫杉醇含量检测，结果显示其紫杉醇含量比未分化愈伤组织要高近1倍。所述的改良MS培养基中的氨态氮为2000～2600mg/L，硝态为800～1000mg/L。

主权项

一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法，步骤包括： （1）外植体预处理：南方红豆杉当年生较成熟幼茎，剪除叶片，用自来水冲洗2～4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15 s，再用0.1% HgCl2浸泡20 min，用无菌水冲洗6～8次后无菌切成0.5～1 cm长的小段备接种用；（2）愈伤组织诱导培养：将茎段无菌接种在增补1～1.5mg/L2,4‑D、3～5mg/L NAA、2～3mg/L6‑BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件：人工气候箱中进行培养，温度(20±5) ℃、湿度（80±5）%黑暗和温度(25±5) ℃、湿度（85±5）%、光照1000‑1200 Lx各12 h交替进行；（3）愈伤组织继代培养：步骤（2）中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补1.5～2.0 mg/L 2,4‑D、3～4 mg/L NAA、0.05～0.2 mg/L KT的MS培养基中进行增殖继代培养；培养条件：人工气候箱中进行培养，温度(20±5) ℃、湿度（80±5）%黑暗和温度(25±5) ℃、湿度（85±5）%、光照1000‑1200 Lx各12 h交替进行；（4）愈伤组织再分化诱导培养：步骤（3）中，继代培养4次，每次培养的周期为20～35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05～0.20mg/L6‑BA、0.2～2.0 mg/L NAA、0.1 mg/LKT、0.5mg/L CH的改良MS培养基中进行再分化诱导培养；培养条件：人工气候箱中进行培养，温度(20±5) ℃、湿度（80±5）%黑暗和温度(25±5) ℃、湿度（85±5）%、光照1000‑1200 Lx各12 h交替进行；（5）收获愈伤组织：步骤（4）中，再分化诱导培养45～75天，南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此时收获愈伤组织；（6）南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化：再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯∶丙酮（1∶1，v/v）浸提过夜，30 ℃超声30 min；过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯∶丙酮（1∶1，v/v）浸提过夜，30 ℃超声30 min；过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯∶丙酮（1∶1，v/v）浸提过夜，30 ℃超声30 min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷（1∶1，v/v）混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后，缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物；步骤（4）中，所述的改良MS培养基中的氨态氮为2000～2600 mg/L，硝态为800～1000 mg/L。