一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法

摘要

本发明提供一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，经过对豚鼠进行EBV病毒接种；豚鼠外周血淋巴细胞分离；RNA提取；RT-PCR逆转录；Nested-PCR扩增；对目的DNA片段进行回收、纯化后，将DNA连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，送至测序公司测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型，以便对EBV病毒包括病原学、免疫学、发病机理等进行研究，以在相关药物的筛选、疫苗评价等应用方面起到重要作用。

主权项

1.一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤：A、将0.1ml病毒滴度为1.0×10⁶~1.0×10⁷的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种；B、接种后1周，取5ml豚鼠血液与5mlRPMI1640培养基混匀，加于10ml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min，使细胞分为四层；C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI1640培养基反复重悬洗2次后收集；D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入1mlTRIZOL，常温静置1h，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min，4℃13500r/min离心15min，取上层液并加入等体积异丙醇，混匀，静置10min，4℃13500r/min离心10min，去上清，向沉淀物中加入1ml-20℃预冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4℃，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNasefreedH₂O溶解，得到总RNA；E、采用20μL反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA；所述反应体系包括：MgCl₂,4μl；ReverseTranscription10XBuffer，2μl；dNTPMixture，2μl；RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor，0.5μl；AMVReverseTranscriptase，15u；Oligo(dT)₁₅Primer，0.5μg；totalRNA，1μg；Nuclease-FreeWater补至20μl；反应条件为：42°C15minutes,95°C5minutes，4°C5minutes；使用β-Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量；F、以cDNA为模板用Nested-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；所述Nested-PCR扩增为：取2μLcDNA加入到48μLPCR反应体系中，EBNA1第一轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃热变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min；第二轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃热变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min；BcLF1第一轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃热变性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环，72℃延伸5min；第二轮PCR程序：94℃预变性1min，94℃热变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸5min，经Nested-PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。