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一种适用于大规模生产的结核分枝杆菌rTPA38蛋白包涵体初纯的方法，包括以下步骤：一、菌体前处理：（1）菌体悬浮：将发酵培养的表达rTPA38蛋白的初始工程菌菌体置37℃恒温水浴锅中解冻，解冻后，按1:20菌体重量（g）／缓冲液体积（mL）的比例用rTPA38菌体悬浮缓冲液稀释，然后在不锈钢菌体处理罐中搅拌至完全悬浮均匀，搅拌电机频率45Hz。包涵体菌体处理罐夹套内通入‑5℃‑0℃冷冻水将菌体悬浮液降至温度低于15℃以下；rTPA38菌体悬浮缓冲液：100mM NaCl，1mM EDTA，50mM Tris‑HCl，pH8.0；（2）菌体破碎：用硅胶管将不锈钢菌体处理罐出料口与高压均质机进料口连接，将菌体悬浮液以1.35L每分钟的流速通入高压均质机，用800bar的压力破碎处理，破碎压力约80MPa，处理后的菌液接入不锈钢桶中，再返回不锈钢菌体处理罐中搅拌冷，却至低于15℃后再次破碎，重复进行，连续三次；（3）离心:将高压均质破碎三次后的菌体破碎液离心4℃，8000rpm，12min，废弃上清液，收集沉淀即得粗包涵体。二、包涵体洗涤（1）第一次包涵体洗涤：a.搅拌悬浮：粗包涵体按1:20包涵体重量（g）／缓冲液体积（mL）的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15‑20分钟至完全均匀，温度约30℃±5℃。b.粗包涵体悬浮液离心：离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为：2%Triton‑X100,100mM NaCl,1mM EDTA,pH8.020mMTris‑HCl，0.5%巯基乙醇；（2）第二次包涵体洗涤：a.搅拌悬浮：将第一次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量（g）／缓冲液体积（mL）的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15‑20分钟至完全均匀，温度约30℃±5℃；b.粗包涵体悬浮液离心：离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为：1%Triton‑X100,100mM NaCl,1mM EDTA,pH8.020mM Tris‑HCl，0.1%巯基乙醇。（3）第三次包涵体洗涤：a.搅拌悬浮：将第二次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量（g）／缓冲液体积（mL）的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15‑20分钟至完全均匀，温度约30℃±5℃。b.粗包涵体悬浮液离心：离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min至20min，收集包涵体沉淀，废弃上清液；缓冲液配方为：1mM EDTA,pH8.020mM Tris‑HCl；（4）第四次包涵体洗涤：a.搅拌悬浮：将第三次洗涤后包涵体沉淀按1:20包涵体重量（g）／缓冲液体积（mL）的比例将rTPA38粗包涵体稀释，然后倒入不锈钢桶中用下磁力搅拌器搅拌悬浮15‑20分钟至完全均匀，温度约30℃±5℃；缓冲液配方为：1mM EDTA,pH8.020mM Tris‑HCl；b.粗包涵体悬浮液离心：离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min至20min，c.收集：收集包涵体沉淀，废弃上清液，即得经初纯后的包涵体，并在‑30℃保存。 |
