抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用。本发明巧妙的利用了虾、WSSV和盐藻细胞三者之间存在的天然联系：WSSV感染虾、虾以盐藻为饵料、盐藻细胞又是一个绿色的表达系统，能够表达生产外源蛋白。通过基因工程手段克隆得到WSSV囊膜蛋白基因，即VP19、VP28，分别构建重组质粒pBI-VP28、pBI-VP19及pBI-VP28+VP19，将构建好的重组质粒转化至盐藻细胞中，筛选培养出稳定表达病毒囊膜蛋白的转化藻株，以该转基因藻株作为活体饵料直接投喂虾体，提高对虾体的免疫保护作用。本发明制备得到的转基因藻株，能稳定表达活性蛋白，蛋白不需要提取，直接作为活体疫苗投喂虾体，操作方便，成本低，安全无毒，免疫效果强。

主权项

1.一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株，其特征在于：根据虾白斑综合征病毒WSSV囊膜蛋白vp28基因设计特异性引物序列：上游引物p1：5’TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC3’，下游引物p2：5’GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG3’，以病毒核酸为模板扩增WSSV囊膜蛋白vp28基因片段并将其插入到真核表达载体中，构建的重组质粒转化至盐藻细胞中得到转基因藻株；所述的真核表达载体为能够转化至盐藻细胞中的载体PBI-，并在盐藻细胞中得以表达；制备方法如下：WSSV囊膜蛋白基因的制备步骤如下：1）WSSV的基因组的制备：取WSSV感染病虾组织，采用30-65%蔗糖浓度，进行常规低温梯度离心法提纯WSSV，提纯后进行电镜观察鉴定病毒纯度和完整性，取纯化病毒加入TE缓冲液，用蛋白酶K在65℃消化10min后，再加入1/10体积NaAc，用等体积酚和氯仿分别抽提一次后，用冷无水乙醇沉淀，然后加入TE溶解，即得到纯净的WSSV的DNA；2）WSSV囊膜基因vp28基因的扩增：根据GenBank中已发表的vp28的序列设计引物，其中vp28的上游引物p1：5’TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC3’，下游引物p2：5’GGATCCAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG3’，上下游引物分别引入XbaⅠ和BamHⅠ，下划线所指，以上述提取的WSSV的DNA为模板PCR扩增vp28，PCR的扩增体系及反应条件如下：PCR反应程序：94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min，经PCR扩增后，得到WSSV囊膜蛋白vp28基因片段；pBI-vp28真核表达载体的构建过程如下：将酶切鉴定和测序鉴定均正确的vp28基因进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，然后采用胶回收方法纯化基因片段，将真核载体PBI-221进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，同样进行胶回收，收集酶切好的载体片段，将切好的基因片段和载体片段按照下列体系建立连接反应，连接体系于16℃水浴放置过夜，次日将该体系转化感受态大肠杆菌，挑起阳性菌落后进行质粒的提取，采用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，连接体系如下：pBI-vp28重组质粒转化至盐藻中的方法如下：采用电击法将重组质粒pUΩ-vp28转入盐藻细胞，具体操作步骤为：收集对数生长期的盐藻细胞，计数，用2×HEPES电击液调整细胞浓度，取400μl2×HEPES悬浮的细胞，加入重组质粒，混匀后加入到0.2cm电击杯内，于冰浴中静置10min后进行电击，电击参数为：电阻400Ω，电压1.5kV进行电击；电击完毕后置于冰浴中静置5min，然后弃去电击液，用PKS培养基悬浮后暗培养12h，然后正常光照培养40h，光:暗比为14:10，采用固体选择培养基进行筛选培养，直至可见单藻落的出现，同时，设置阴性对照组，该组的实验操作过程相同，惟一不同之处即不加入重组质粒；表达外源基因转化盐藻株的筛选和鉴定方法如下：取生长至对数期的转基因盐藻细胞，离心5min沉淀盐藻体，然后采用常规基因组提取法提取盐藻基因组DNA，以盐藻基因组DNA作为模板，进行目的基因vp28的PCR扩增，取PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用Trizol试剂提取法提取盐藻的总RNA，采用RT-PCR的方法进行目的基因的扩增，以查明目的基因在转录水平是否表达，选取鉴定正确的阳性转化株，连续传代培养3个月以上，获得表达外源基因的转化株，同时，进行Western blot分析，对目的蛋白的表达量和活性进行分析鉴定。