中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法

摘要

本发明公开了一种中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法，其中，该方法包括步骤：（a）通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物：(b)酶标板的准备：(c)试验试剂的配置和稀释：将浓缩洗涤液混合均匀（如果里面有晶体，要充分溶解混匀后再使用），按照浓缩洗涤液和去离子水（或者蒸馏水）1:19的比例稀释后放4℃储存备用；(d)选用双抗体夹心ELISA方法来完成抗体试验，加入封闭液，对取出的微孔条进行封闭处理：（e）用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果，计算浓度。本发明的检测方法具有特异、灵敏、高效、易操作、造价低廉等优点，且能同时分析大量的样本，是一种对目标抗原进行定性定量分析的有效手段。

主权项

一种中肋骨条藻的酶联免疫反应检测方法，其特征在于，该方法包括步骤：（a）通过反复在显微镜下挑取单个藻细胞获得纯培养物：所用的培养基是常规的f/2培养基，培养条件为：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lx，培养温度为22℃～25℃；处于对数生长期的中肋骨条藻培养液，用0.45um的醋酸纤维膜过滤，得到滤膜，记录体积。将得到的滤膜放入5ml离心管中，加入2ml SD缓冲液，超声波破碎2min，得到待检测的样品溶液；(b)酶标板的准备：将制备的中肋骨条藻的酶标板，选取适量的微孔条固定于酶标板的支架上，对其微板孔进行编号，平衡至室温（18‑25℃）备用；微板开封以后，剩下的在密封袋中密封，4℃保存；(c)试验试剂的配置和稀释：将浓缩洗涤液混合均匀（如果里面有晶体，要充分溶解混匀后再使用），按照浓缩洗涤液和去离子水（或者蒸馏水）1:19的比例稀释后放4℃储存备用；(d)选用双抗体夹心ELISA方法来完成抗体试验，加入封闭液，对取出的微孔条进行封闭处理：在反应孔中加入中肋骨条藻SD缓冲液25ul；在相对应的微板孔中分别加入75ul中肋骨条藻标准样品（中肋骨条藻标准样品S1，S2，S3，S4，S5，S6）和待测样品，在37℃条件下温育30分钟后用配制好的洗涤液充分洗涤5次，然后扣干（每次应该保持30‑70秒钟浸泡时间）；在每个反应孔中加入100ul酶标抗体（中肋骨条藻抗体ED），在37℃条件下温育30分钟。酶反应完成后，用配制好的洗涤液充分洗涤5次，洗涤后扣干（每次应保持30‑60秒浸泡时间）；在每个反应孔中加入抗体显色A液和抗体显色B液各50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色反应30分钟，最后在每孔中加入50ul终止液，终止反应；（e）用酶标仪单波长450nm或者双波长450nm/630nm检测参与反应的酶标二抗在显色后的OD值（用单波长测定时，需要用空白对照孔调零），记录结果，计算浓度。以梯度稀释的中肋骨条藻的标准样品藻液为例进行破碎处理后按照双抗体夹心ELISA方法的步骤，最后获得的曲线方程是：y=0.0521x+0.0536，相关系数R2=0.999（x是103个/毫升，y是OD值），本试剂盒的检测限度最小浓度为1.0*103个/毫升。