多模式光学高分辨显微镜

摘要

本发明提供了一种多模式光学高分辨显微镜，集成了多种先进显微光学成像技术，可以在一台显微系统里同时实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子融合成像，形成一个多功能的高分辨光学显微镜，能够适用于多种研究领域，成为生物医学强有力的研究工具。

主权项

一种多模式光学高分辨显微镜，其特征在于，包括第一STED照明单元、第二STED照明单元、飞秒激光、合束分束二色镜单元、物镜、三维纳米位移台、荧光成像单元和控制单元；所述第一STED照明单元包括第一损耗光激光、第一涡旋相位片、第一1/4玻片、第一二色镜和第一激发光激光，所述第一涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0‑2π位的涡旋相位分布，所述第一1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光；所述第二STED照明单元包括第二损耗光激光、第二涡旋相位片、第二1/4玻片、第二二色镜和第二激发光激光，所述第二涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0‑2π位的涡旋相位分布，所述第二1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光；所述合束分束二色镜包括与所述第一STED照明单元和所述第二STED照明单元的光路连接的第三二色镜、与所述第一STED照明单元和所述飞秒激光光路连接的第四二色镜及第五二色镜；所述荧光成像单元包括带通滤波片、成像透镜、针孔及光电倍增管；所述控制单元与所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光、飞秒激光、三维纳米位移台及光电倍增管电性连接，所述控制单元用于控制所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光及飞秒激光的开启和关闭及控制所述三维纳米位移台沿X Y Z方向的移动；所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、所述第二损耗光激光和所述飞秒激光并控制开启所述第一激发光激光和/或所述第二激发光激光，所述第一激发光激光出射的光束经所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发所述样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色 镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现共聚焦显微成像；所述控制单元控制关闭所述飞秒激光并控制开启所述第一损耗光激光和所述第一激发光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一涡旋相位片和所述第一1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，经所述第四二色镜反射后的光束再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述第一激发光激光出射的光束所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED成像；所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光，并控制开启所述飞秒激光，所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光， 透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现双光子成像；所述控制单元控制关闭所述第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光并控制开启所述飞秒激光和第一损耗光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一涡旋相位片和所述第一1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED双光子融合成像。