制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法

摘要

本申请涉及制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。具体而言，对于UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶(该酶中，通过仅用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过进一步用谷氨酰胺取代266位的精氨酸诱导了点突变)而言，该酶的表异构酶活性维持不变，不受CMP-唾液酸浓度的影响，并且，过表达该酶的细胞的胞内单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸含量得以提高。特别是，由于在产生糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的宿主细胞中(在该宿主细胞中，人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因同时得到过表达)，细胞中的胞内CMP-唾液酸含量和糖蛋白中的唾液酸提高，因此，在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中，上述3种基因的过表达可用于制备唾液酸含量提高的糖蛋白。

主权项

制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括：1）制备包含编码UDP‑GlcNAc2‑表异构酶/ManNAc激酶（GNE/MNK）的基因、编码α‑2,3‑唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷（CMP）‑唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位的精氨酸被亮氨酸取代、且266位的精氨酸被谷氨酰胺取代的氨基酸序列构成，所述α‑2,3‑唾液酸转移酶由SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列构成，所述CMP‑唾液酸转运体由SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列构成；2）将步骤1）中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的哺乳动物宿主细胞中以制备转染子；以及3）孵育步骤2）中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。