带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种带有标签的肠道病毒71型全长感染性克隆的制备方法及应用，其步骤是：（1）总RNA的提取；（2）EV71的RT-PCR扩增；（3）EV71亚克隆的构建；（4）含有EV71基因的重组克隆的构建；（5）带有eGFP和DsRed的EV71全长感染性克隆的构建。通过细胞病变、荧光检测、基因检测、病毒蚀斑和药物抑制等实验证明成功获得带有标签的EV71全长感染性克隆。本发明在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选和药物作用机制、疫苗和诊断试剂的研发等方面具有广泛的应用价值。

主权项

一种带有绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白标签的EV71型全长感染性质粒构建方法，其步骤是：（1）总RNA的提取：取140μl的EV71病毒液，按照QIAamp Viral RNA试剂盒说明书的要求抽提EV71的RNA；（2）EV71的RT‑PCR扩增：根据EV71基因的特性，将该基因分为了四个部分，分别命名为F1、F2、F3和F4，以步骤（1）中的总RNA为模版，采用RT‑PCR分别获得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，DNA片段F1的引物：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，DNA片段F2的引物：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，DNA片段F3的引物：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，DNA片段F4的引物：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，另外SEQ ID NO:5含有T7RNA聚合酶启动子序列SEQ ID NO:13；RT‑PCR的反应体系均为：PrimeScript1Step Enzyme Mix：2μl，2×1Step Buffer：25μl，引物：1μl，引物：1μl，模板RNA为：3μl，无RNase水：18μl；扩增条件为：50℃30min，94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28个循环；（3）EV71亚克隆的构建：将步骤（2）中获得的片段F1、F2、F3、F4分别和载体pUC19连接，并将连接产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19‑F1、pUC19‑F2、pUC19‑F3和pUC19‑F4；（4）含有EV71基因的重组质粒的构建：用BsiwI和HindIII酶切步骤（3）中获得的pUC19‑F1和pUC19‑F2，回收pUC19‑F1的大片段和pUC19‑F2的小片段，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19‑F1‑F2；用SpeI和HindIII酶切步骤（3）中获得的pUC19‑F3和pUC19‑F4，回收pUC19‑F3的大片段和pUC19‑F4的小片段，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19‑F3‑F4；用AatII和HindIII酶切pUC19‑F1‑F2和pUC19‑F3‑F4，回收pUC19‑F1‑F2的大片段和pUC19‑F3‑F4的大片段，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用 T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4；用XbaI和HindIII酶切pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4和pACYC177，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的pUC19‑F1‑F2‑F3‑F4和经过酶切的pACYC177，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC‑EV71‑FL；（5）分别带有eGFP和DsRed标签的EV71全长感染性克隆的构建：以带有eGFP和DsRed基因的质粒为模版，使用PrimeSTAR HS酶，分别使用特异引物扩增eGFP和DsRed基因片段，两种荧光标签序列为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17，扩增DsRed的引物为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测RT‑PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收DNA片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用浓度为1%w/v的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于‑20℃保存备用；PCR的反应体系均为5×PS buffer：10μl，dNTP：4μl，引物：0.5μl，引物：0.5μl，模板：0.5μl，PrimeSTAR HS酶：0.5μl，水：34μl。扩增条件为：98℃30s，94℃10s，55℃15s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环；将获得的eGFP基因片段和DsRed基因片段和步骤（4）中的pACYC177‑EV71‑FL分别为用SphI和MluI酶切，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收经过酶切的eGFP基因片段、DsRed基因片段和pACYC177‑EV71‑FL，使用浓度为1%w/v琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后使用T4DNA连接酶连接经过回收的DNA片段，并将连接产物转化感受态HB101，将PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pACYC177‑EV71‑eGFP‑FL和pACYC177‑EV71‑DsRed‑FL。