在牛MSTN基因中引入移码突变的方法

摘要

本发明公开了一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法。本发明构建了一个牛MSTN基因移码突变的打靶载体，通过同源重组将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子。首先合成出包含移码突变的MSTN同源短臂，使其在第3外显子上缺失11bp，形成移码突变；然后合成MSTN的同源长臂，利用酶切位点插入载体pFPC-1，构建出牛MSTN基因移码突变的打靶载体pFPC-MSTN。得到的打靶载体线性化后转染牛体细胞，通过同源重组在牛MSTN基因中引入移码突变，利用这种细胞可以在生产中得到MSTN基因移码突变的转基因牛，从而提高其产肉性状，提高牛肉的品质与产量。

主权项

一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建：合成构建的同源短臂是从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共11bp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一个XbaⅠ酶切位点，3’端引入了一个PmeⅠ酶切位点；（2）牛MSTN基因同源长臂的构建：合成构建的同源长臂是从牛的MSTN基因的第1bp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子1及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一个PacⅠ酶切位点，3’端引入了一个NotⅠ酶切位点；（3）打靶载体的构建：①用PacⅠ和NotⅠ双酶切所述同源长臂及pFPC‑1载体，通过连接酶连接，使所述同源长臂插入质粒载体pFPC‑1的 PacⅠ和NotⅠ酶切位点；②用XbaⅠ和PmeⅠ双酶切所述同源短臂和步骤①获得的插入有同源长臂的质粒载体pFPC‑1，通过连接酶连接，使所述同源短臂插入到XbaⅠ和PmeⅠ酶切位点，得到打靶载体pFPC‑MSTN；（4）牛MSTN基因移码突变的引入：①用PacⅠ或PmeⅠ单酶切处理所述打靶载体pFPC‑MSTN使其线性化，用脂质体转染试剂转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo‑TK及移码突变引入牛MSTN基因中，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选；②用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞，进行病毒包装，通过反复冻融转染293细胞收集病毒，利用收集的病毒感染步骤①所得的筛选后的细胞株，用Cre酶的活性删除loxp位点当中的筛选基因Neo‑TK，用GANC筛选出成功删除Neo‑TK后的细胞株；在牛基因中引入了MSTN基因移码突变；所述步骤（3）的①步中是用胶回收酶切产物得质粒载体pFPC‑1；②步中是用胶回收酶切产物得到打靶载体pFPC‑MSTN，然后通过转化大肠杆菌DH5α，酶切鉴定连接效果。