一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸及其制备方法。本发明提供的检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的硝酸纤维素膜、连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体。本发明的实验证明，用本发明提供的试纸检测恩诺沙星，灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。

主权项

一种检测恩诺沙星的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有恩诺沙星抗原，所述质控线含有能与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体；所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体为恩诺沙星抗体和超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体；所述恩诺沙星抗体为恩诺沙星单克隆抗体；所述恩诺沙星抗原为恩诺沙星半抗原与载体蛋白的偶联物；所述恩诺沙星半抗原为恩诺沙星；所述载体蛋白为BSA；所述载体蛋白与恩诺沙星半抗原的偶联比为1:10；所述与所述恩诺沙星抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述恩诺沙星抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为1mg/ml；所述超顺磁性复合粒子为Fe3O4纳米粒子；所述超顺磁性复合粒子的粒径为100nm；所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度为40emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒；所述超顺磁性复合粒子表面的羧基含量为80μmol/g；所述恩诺沙星抗体亲和常数为108M‑1；所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体按照如下方法制备：1）将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳二亚胺、1.15mg N‑羟基丁二酰亚胺和1ml浓度为0.1M、pH值为4.7的2‑(N‑吗啡啉）乙磺酸缓冲液混匀，反应，得到活化后磁性粒子；反应温度为37℃，反应时间为0.5h；2）将每2.5mg步骤1）得到活化后磁性粒子、0.15mg恩诺沙星抗体和0.8ml浓度为50mM pH为8.5的硼砂缓冲液混匀、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；反应温度为25℃，反应时间为3.5h；3）向步骤2）得到的反应液中加入BSA混匀得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；反应温度为37℃，反应时间为0.5h；所述BSA在所述混合液中的质量百分浓度为5%；所述恩诺沙星抗原按照如下方法制备：A）取每35.9mg恩诺沙星、3ml N,N‑二甲基甲酰胺和3ml二氧六环混合得到混合液a，所述混合温度为25℃，所述混合时间为30min，所述混合的方式为震荡；B）将每6ml的步骤A）得到的混合液a和26.2μl三丁基正胺混合，得到混合液b，向混合液b中加入1.5μl氯甲酸异丁酯反应；得到活化好的恩诺沙星溶液；所述混合的 温度为4℃，所述混合的时间为15min，所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为1h；C）取每100mg载体蛋白溶解于10ml浓度0.1mol/L，pH为8.5的硼酸钠溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；D）将每6ml步骤B）得到的活化好的恩诺沙星溶液加入10ml步骤C）得到的所述载体蛋白硼酸溶液中，反应，得到混合液c，透析、冻干，得到恩诺沙星抗原；所述反应的温度为4℃，反应时间为12h；所述超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的制备方法中：在所述步骤3）后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬浮，得到超顺磁性复合粒子标记恩诺沙星抗体的步骤，所述洗涤液和悬浮液均为浓度为0.02M pH为7.4的PBS缓冲液。