一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法

摘要

发明公开了一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法。首先取反应产物60μl行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶,按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取2μl回收的DNA与1μl载体PMD18-T连接,总体积10μl,10℃过夜,将连接后PMD18-T转化至DH5α感受态细胞200μl中,铺于LA平板37℃孵育16。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长，成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

主权项

一种真核表达时PCR产物回收与鉴定的实验方法，其特征在于，取反应产物60μl 行1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外分光仪监测下用手术刀片切取含目的基因条带之凝胶, 按照试剂盒说明进行凝胶回收DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；取2μl 回收的DNA 与1μl 载体PMD18‑T 连接, 总体积10μl , 10℃ 过夜, 将连接后PMD18 ‑T 转化至DH5α感受态细胞200μl 中, 铺于LA 平板37℃孵育16h；随机挑取LA 平板上数个单菌落, 分别接种于5ml LA 液体培养基中37℃ 180r/min 震荡过夜, 按照提取试剂盒说明提取质粒, 并分别用BamH I 和EcoR I 进行双酶切, 反应体系50μl: 质粒20μl, BamH I 和EcoR I 各1μl, Buffer 5μl, dH2O 23μl, 37℃水浴酶切25h, 65℃水浴30min。