| 主权项 |
牛奶中雌激素的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对牛奶样品进行丹磺酰氯衍生化预处理；2）通过在线固相萃取‑二维液相色谱串联质谱分析，测定牛奶样品中雌激素的含量；步骤1）中丹磺酰氯衍生化具体方法为：取3mL牛奶样品，加入3种氘标记的雌激素内标蜗旋混匀；样品加入30%的三氯乙酸100μL沉降蛋白；混匀后加入等体积混合的乙酸乙酯和正己烷溶剂8mL，震荡提取10min，10000转离心10min后，分离上层溶液用氮气吹干；重复提取样品2次，将氮气吹干的残渣用1mL乙腈溶解，50℃孵育5min后蜗旋混匀30s，‑20℃冷冻30min；然后样品于10000转离心5min，将上层溶液转移至另一试管中蒸干，加入150μL碳酸氢钠缓冲液蜗旋重新溶解样品，然后加入150μL丹磺酰氯丙酮溶液混匀，60℃衍生化5min，用0.22μm微孔滤膜过滤样品，供下一步检测使用；步骤2）具体操作为：I.绘制标准曲线：称取8份空白牛奶样品，每份3mL，分别添加相同浓度的3种氘标记的雌激素内标，内标的终浓度为50ng/L，依次添加不同浓度的雌激素标准品，使其终浓度分别为0ng/L、2.0ng/L、5.0ng/L、10.0ng/L、20.0ng/L、40.0ng/L、80.0ng/L和100ng/L；样品上样，进行在线固相萃取‑二维液相色谱串联质谱分析；以添加样品中被测组分峰面积和内标物峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液中被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标绘制标准曲线；II.牛奶样品中雌激素的定量：将步骤1）预处理后的牛奶样品上样，进行在线固相萃取‑二维液相色谱串联质谱分析，用标准曲线对样品进行定量，样品溶液中待测 物的响应值均应在仪器测定的线性范围内；固相萃取采用的洗脱条件为：步骤总时间(min)流速(μL/min)流动相A(%)流动相B(%)00.0050045.055.012.5050045.055.022.605001.099.034.005001.099.044.2010045.055.0513.0010045.055.0其中流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸甲醇；液相色谱分析条件为：步骤总时间(min)流速(μL/min)流动相C(%)流动相D(%)00.0045050.050.012.5045050.050.029.5045015.085.0310.004505.095.0411.004505.095.0511.5045050.050.0613.0045050.050.0其中流动相C：0.1%甲酸水；流动相D：0.1%甲酸乙腈；质谱分析条件为：离子源：电喷雾离子化源，正离子方式检测；离子源电压：+5500V；温度：500℃；源内气体1为N2，压力65psi；气体2为N2，压力55psi；气帘气体为N2，压力15psi；扫描方式为多反应离子监测；碰撞气为N2，压力5psi；所述雌激素为雌酮、α‑雌二醇、β‑雌二醇和雌三醇中的一种或多种。 |
