一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用

摘要

发明属于生物检测技术领域，涉及一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法，并提供该方法的应用途径。适用于检测硫化氢合成酶包括CBS、CSE及CL的活性，对于组织样品，先剪成小块再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液进行裂解，裂解产物进行蛋白定量，如图，反应体系(组织细胞裂解产物、L-半胱氨酸、5-磷酸吡哆醛)加在反应瓶外圈的反应池中，吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)加在内圈的吸收池中，反应体系产生H2S气体分子与吸收体系的荧光探针相结合，可用于荧光测定和荧光成像，定量检测H2S含量，更为直观地反映H2S合成酶的活性。本发明可为研究H2S相关的信号通路以及H2S在一些疾病过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。

主权项

一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法，其特征是： (1)本发明的检测方法适用于检测CBS、CSE及CL(需另外加入亚硝酸盐)的活性，实验步骤如下：对于组织样品，先剪成小块，再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液(强)进行裂解(碧云天生物技术所，南通，中国)；细胞裂解产物经蛋白定量后，加入反应瓶中，反应体系加在外圈的反应池中，包括2mmol/L 5‑磷酸吡哆醛400μl，10mmol/L L‑半胱氨酸40μl及组织细胞裂解液，并用100mmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4)定容至2ml。吸收体系加在内圈的吸收池中，即加入20μmol/L硫化氢荧光探针工作液1ml，其中含有反应佐剂溴烷铵(CTAB，10μmol/L)。在37℃的密闭环境中吸收反应60min，取吸收池的溶液可用于荧光测定和荧光成像； (2)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的组织细胞裂解方法为：直接加入缓冲液，经‑20℃室温反复冻融裂解。本发明的裂解方法为：用碧云天生物技术所提供的组织细胞裂解液(强)进行裂解，对于55mm细胞培养皿加入100μl细胞裂解液即可。 (3)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的反应瓶吸收体系为：取0.5ml2％醋酸锌(调节PH值至碱性)加入中央的吸收池中，向锥形瓶充入适量的氮气，以胶塞封口，将锥形瓶置于37℃恒温箱中，轻摇120min，用50％三氯醋酸0.5ml中止反应后，继续反应60min，彻底吸收硫化氢。本发明的吸收体系为：含有反应佐剂溴烷铵(CTAB，10μmol/L)的硫化氢荧光探针工作液，在37℃的密闭环境中吸收反应60min； (4)检测硫化氢合成酶活性试验，传统的检测方法为亚甲基蓝检测法：将吸收池中的醋酸锌混匀后，吸取0.4ml(枪头注意不接触锥形瓶壁)，加入7.2mol/L对苯二胺40μl，1.2mol/L三氯化铁40μl，室温反应20min后，用酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)检测670nm波长处的吸光度值。绘制H2S标准曲线可定量分析。本发明的检测方法为：取吸收池溶液，用AMG荧光显微镜(Advanced Microscopy Group，USA)进行荧光成像，或用全波长扫描多功能读数仪(Varioskan Flash3001)进行荧光测定(λex(max)＝476nm，λem(max)＝513nm)，绘制H2S标准曲线可进行定量分析。