一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法

摘要

本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，属于生物技术领域。该方法将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体，通过农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种病毒后都表现对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状。本发明利用RNAi技术可以培育抗TYLCV番茄转基因株系，为防治TYLCV提供了技术支持。

主权项

一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法,包括：1) 分别利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有番茄黄化曲叶病毒TYLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和C1基因，所述V2基因和C1基因的序列分别为SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示；F1 CAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCTR1 AACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2 GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2 GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG2) 将SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2 PCR产物混合，以引物F1和R2进行PCR扩增,得到V2和C1的嵌合基因，含有序列SEQ ID NO.3，含有SEQ ID NO.3的嵌合基因PCR产物与pGEM‑T 载体连接，得到T‑V2C1；3) 以T‑V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体iHp用BamHI和HindIII酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp‑T‑V2C1；F3 CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3 TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG4) 以T‑V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp‑T‑V2C1以XhoI和SacI酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp‑V2C1；F4 GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTGR4 GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA5) 用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121和iHp‑V2C1，回收酶切的目的片段，用T4‑DNA连接酶连接，构建RNAi载体pBI121‑V2C1；6) 农杆菌介导法将RNAi载体pBI121‑V2C1转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄；将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4‑6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄；或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携带TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。