基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法

摘要

本发明公开了一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，构建荧光供体克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS；受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP等；在MCS处选择合适酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处；产生BRET信号的模式体；检测三个BRET模式体的荧光素酶的荧光强度；选择三个荧光强度值都较强的模式体作为BRET信号产生的荧光供体；通过生物荧光显微镜(Leica)检测荧光蛋白的表达情况，选择合适的荧光受体；通过荧光分光光度计检测BRET模式体的信号。本发明通过细菌荧光素酶luxAB作为检测两蛋白互作的荧光供体与eYFP作为荧光受体产生BRET信号，构建BRET模型，该系统可以在体内检测两个蛋白的动态互作，提高了检测蛋白质相互作用的准确性，作为检测原核细胞内蛋白质互作的较理想系统。

主权项

一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，该基于细菌荧光素酶BRET检测蛋白质相互作用的方法包括以下步骤：包括以下步骤：步骤一，构建克隆pBluescript‑pLac::luxAB‑MCS；步骤二，受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP、增强型黄色荧光蛋白eYFP、橙色荧光蛋白mOrange；步骤三，在MCS处选择酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处；步骤四，去掉luxB的终止密码子TAA，形成细菌荧光素酶和荧光蛋白的融合体；步骤五，分别得到pBluescript‑pLac::luxAB‑GFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑eYFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑mOramge三个重组载体，产生BRET信号的模式体；步骤六，通过酶标仪检测三个BRET信号模式体荧光素酶的荧光强度；步骤七，选择三个模式体荧光强度值都较强作为BRET信号产生的荧光供体；步骤八，通过生物荧光显微镜Leica检测荧光蛋白，选择合适的荧光受体。