产丁二酸基因工程菌及其构建及应用

摘要

本发明提供了一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA016（EscherichiacoliBA016），其保藏号登记号为CCTCC M2012350。本发明还提供了该菌株的构建方法与发酵生产丁二酸的方法，通过过量共表达外源丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，使重组大肠杆菌能够利用葡萄糖代谢生长，减少副产物丙酮酸的生成，从而大幅度提高丁二酸的得率及生产强度。

主权项

一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA016（Escherichia coli BA016），其保藏登记号为CCTCC M 2012350；其具体构建步骤如下：（1）以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，得到同时缺乏ldhA、pflB的感受态菌株；（2）纯化扩增出丙酮酸羧化酶基因，构建得到表达丙酮酸羧化酶的表达质粒pTrc99a‑ pyc；（3）纯化扩增出烟酸磷酸核糖转移酶基因，连接到步骤（2）所述的重组质粒pTrc99a‑ pyc上，构建得到过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒pTrc99a‑ pyc‑ pncB；（4）将步骤（3）中得到的质粒导入步骤（1）的感受态菌株，获得阳性转化子；（5）利用步骤（4）得到的阳性转化子过量共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时，减少丙酮酸的积累，得到大肠埃希氏菌 BA016。