一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，是将兔抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体、胶体金标记重组猪干扰素ɑ单克隆抗体根据抗原抗体反应原理，分别固定在硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜上，组成重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条。试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及PVC底板4个部分组成，样品垫用玻璃纤维素膜。本发明建立了敏感快速的检测重组猪干扰素ɑ样品的方法，具有高特异性，高稳定性，供实验室和市场上对重组猪干扰素ɑ产品的鉴定和验证用。

主权项

一种重组猪干扰素ɑ双抗体夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的制备：小鼠腹腔内注射0.5 ml液体石蜡，第7 d后每只小鼠腹腔注射1×107/ml抗重组猪干扰素ɑ杂交瘤细胞悬液0.5 ml，7~10 d后观察小鼠腹部膨胀程度收集腹水，经离心去沉淀后以辛酸‑饱和硫酸铵粗纯，再以DEAE阴离子交换层析进一步纯化抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，‑80℃保存；（2）胶体金的制备：取0.01％ HAuCl4 水溶液100 ml，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5 min，制成粒径40 nm 金颗粒，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，冷却至室温后4℃避光保存；（3）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体：用0.1 mol/L K2CO3将胶体金溶液调到pH8.2，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100 ml溶液加入4.5 mg纯化的抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体，将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，再滴加入到终浓度为0.05％的PEG 20000或l％的BSA封闭，标记结束后2500 r/min离心18~22 min，去除大的聚合物，再将上清以12000 r/min离心28~32 min，弃去上清，以含0.05％PEG的0.01 mol/L PBS重悬沉淀，离心，重复操作两次，最后以原体积1/10（含0.05％PEG）0.01 mol/L PBS重悬沉淀，3~5℃下保存，然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20~25℃干燥2~4 h，制成胶体金垫，干燥备用；（4）胶体金标记抗重组猪干扰素ɑ单克隆抗体的纯化：先1800r/min、4℃低速离心18~22min，弃去凝聚的沉淀，然后14000r/min 、4℃高速离心1~1.2h，吸出上清，沉淀物用0.0l mol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经1500r/min离心18~22min，取上清加至AKTATM explorer蛋白纯化仪葡聚糖凝胶层析柱纯化，将纯化的胶体金标记结合物过滤除菌、分装，4℃保存；（5）抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体的包被：用0.0l mol/L pH7.4 PBS将抗重组猪干扰素ɑ多克隆抗体稀释为l mg/ml，然后用喷膜仪将抗原在硝酸纤维素膜上按1µl/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上包被羊抗鼠多克隆抗体，用于产品的质控，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间干燥6~8h，备用；（6）试纸条的组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4 mm宽的试纸条，再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。