基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法

摘要

一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1)将耐核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2)加入成分包括不具有核酸外切酶活性之DNA聚合酶的延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。

主权项

一种非诊断治疗的基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于：1) 将耐3’‑5’核酸外切酶消化的测序引物固定于核壳型γ‑Fe2O3@Au金磁颗粒上，与待测DNA序列进行杂交；2) 平行进行四组反应，加入第一步延伸反应溶液，溶液成分包括不具有3’‑5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶、四种经过标记的双脱氧核糖核苷酸单体ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP中的一种及其对应的脱氧核糖核苷酸单体dATP、dTTP、dCTP、dGTP，所述脱氧核糖核苷酸单体也是经过标记的，且每组脱氧核糖核苷酸单体是不同的，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3) 加入成分包括具有3’‑5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’‑5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4) 对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息；所述不具有3’‑5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶或T7测序酶；所述具有3’‑5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶；所述耐3’‑5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为硫化修饰的dNTPαS；所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP；经过标记的dNTP与ddNTP，其中ddNTP与同种类dNTP之间的分子数比例为1:50~1:10000；采用线性方式依次读取完整核苷酸序列或采用阵列方式读取部分核苷酸序列后再利用序列拼接软件进行拼接。