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一种黑胸大蠊浓核病毒定性定量的检测方法，其步骤如下：1） 病毒粒子纯化将样品悬浮于磷酸缓冲溶液，匀浆后以5000r/min离心3min；上清液加入硫酸铵至350g/L，硫酸铵水溶液饱和度为55％，放置于4℃冰箱内静置12‑14小时，然后以8000r/min离心50min,沉淀加入PBS重悬浮，匀浆后，以15000r/min离心20min，上清液以40000r/min离心2h，取沉淀；匀浆离心后，上清液经40％蔗糖单梯度，以40000r/min离心5h，沉淀悬于PBS中，匀浆，以12000r/min离心20min，得上清，再经过10％～40％蔗糖线性梯度，以26000r/min离心2.5h；经10％～40％蔗糖梯度离心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管，用紫外分光光度计测定每管在260nm处的吸收值，绘制吸收曲线；将峰值管的收集液洗糖，以40000r/min离心2h,PBS悬浮，即为提纯病毒；2）病毒粒子的沉降特征以家蚕浓核病毒伊那株和家蚕传染性软化病毒作为对照，将纯化的黑胸大蠊浓核病毒样品稀释10倍上样，铺在10％～40％蔗糖线性梯度上层，121700g离心3.5hr，以形成沉降区带；部分收集器收集，每管0.75mL，收集50管，分别测定260nm光吸收值，并对应收集管号绘制曲线，收集出现光吸收峰的区带病毒，测定病毒的沉降特性；黑胸大蠊浓核病毒沉降系数为102S，病毒粒子密度为1.45g/cm3；3）蟑螂病毒的形态测定纯化的蟑螂病毒粒子用2％磷钨酸染色，透射电子显微镜下检查，病毒为大小均一的近似球状二十面体的粒子，加入直径15nm的烟草花叶病毒作为标准，测定其直径；4）蟑螂病毒核酸检测 a)蟑螂病毒核酸提取纯化的蟑螂病毒悬液与等体积TE饱和酚混匀，室温下置40－60min，期间数次摇动；酚处理后以10000r/min离心5min，取水相，重复两次，再用等体积的氯仿：异戊醇=24：1抽提，取水相，加1/10体积的3mol/L乙酸钠，2.5倍体积无水冷乙醇， ‑20℃静置4小时，以15000 r/min离心10min，沉淀真空干燥后，悬浮在pH8.0TE缓冲液中，即为蟑螂病毒核酸；b)蟑螂病毒核酸电泳检测及其分子量采用核酸的琼脂糖电泳方法检测其核酸分子量，用1×TBE配制的琼脂糖浓度为1.9％；电泳时以HindⅢ酶切的λDNA作标准，电泳结束后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察照相，计算病毒核酸的大小；5）样品的处理制备检测病毒悬液，取1mL，精确至0.01 mL试样，溶解于10mL蒸馏水中，然后10倍梯度稀释样品S1(1/10)→S2 (1/10),再用1μL磷钨酸与1μL样品重复混匀后滴在铜网上，自然干燥后直接电镜检测计数，要求电镜视野中的病毒颗粒不重叠，每网孔中的病毒数不少于4个；6）计算有效网孔中病毒的总和P＝P1+P2+P3+……+Pn,重复3次取平均值，蟑螂浓核病毒含量x用式（1）进行计算：x＝P×10×10S×1000式中：P—电镜下统计的总数； S—梯度稀释的次数。 |
