一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达时RT-PCR的方法

摘要

本发明公开了一种VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达时RT-PCR的方法。取细胞总RNA约5ng,按cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应,引物为随机引物oligodt,反应总体积20μl；取2μl进行PCR反应,使用特异性引物,反应总体积50μl。所述反应在以下条件下进行：94℃5min,94℃30s,60℃30s,72℃1min循环35次,末次延伸72℃7min;取10μlPCR产物进行琼脂抗凝胶电泳鉴定,以β-actin为内对照。本发明的有益效果是，基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

主权项

一种VEGF ‑C 真核表达载体的构建和体外表达时RT‑PCR的方法，其特征在于，取细胞总RNA 约5ng , 按cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应, 引物为随机引物oligodt , 反应总体积20μl ；取2μl 进行PCR 反应, 使用特异性引物, 反应总体积50μl 。