| 主权项 |
包含至少第一和第二对靶序列富集引物和至少第一对用于在靶序列富集步骤中被扩增核酸的通用扩增的靶序列扩增引物的反应混合物在制备基于多重引物从多种病原体扩增至少一个靶序列的试剂盒中的应用，所述靶序列扩增引物是正向超级引物FSP和反向超级引物RSP，所述第一对靶序列富集引物，即外侧正向引物和外侧反向引物，结合包含所述至少一个靶序列的核酸并将所述至少一个靶序列包括在内，即外侧正向引物和外侧反向引物之一位于所述至少一个靶序列的5’端或左侧，另一个位于所述至少一个靶序列的3’端或右侧，所述第二对靶序列富集引物，即内侧正向引物和内侧反向引物，结合包含所述至少一个靶序列的核酸并且将所述至少一个靶序列包括在内，其中所述第二对靶序列富集引物结合包含靶序列的核酸，使得所述第二对靶序列富集引物与第一对靶序列富集引物相比位于更接近靶序列的位置，所述靶序列富集引物以低浓度存在并且未被标记，所述靶序列扩增引物以高浓度存在，其中“低浓度”指不足以进行给定靶序列的指数扩增，但足以进行给定靶序列的靶富集的引物的浓度，“高浓度”指足以进行给定靶序列的指数扩增的引物的浓度，其中a.第一扩增反应使用i)来自至少一种病原体的核酸作为模板，所述核酸包含来自所述病原体的至少一个靶序列，所述核酸包含所述至少一个靶序列；ii)第一对靶序列富集引物与所述核酸杂交并且将所述至少一个靶序列包括在内；iii)第二对靶序列富集引物与所述第一对靶序列富集引物内部的所述核酸杂交，并且将所述至少一个靶序列包括在内，所述第二对靶序列富集引物位于最接近所述至少一个靶序列的位置，并且第二对靶序列富集引物的一个在其5′末端包含对应于靶序列扩增引物对的一个的序列的超级引物结合标志物，和第二对靶序列富集引物的另一个在其5′末端包含对应于靶序列扩增引物对的另一个的序列的超级引物结合标志物；和iv)用于所述第一扩增反应的扩增试剂和条件，从而其使第一扩增反应产生多个第一扩增产物，其中第一扩增产物的至少一个部分包含所述至少一个靶序列和一个所述靶序列富集引物的超级引物结合标志物的至少一个补体，由此形成至少一个所述靶序列扩增引物的至少一个结合位点；和b.第二扩增反应使用i)包含所述至少一个超级引物结合位点的第一扩增产物的所述部分作为模板；ii)所述第一对靶序列扩增引物结合于在所述第一扩增产物的所述部分上的所述超级引物结合位点；iii)用于所述第二扩增反应的扩增试剂和条件使第二扩增反应产生多个包含至少一种所述靶序列的第二扩增产物。 |
