大流行流感病毒裂解疫苗

摘要

本发明提供了一种大流行流感病毒裂解疫苗及其制备方法，所述方法采用WHO推荐的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1))株毒种，经接种鸡胚(产量高、操作容易)、培养、收获病毒液、灭活病毒、蔗糖密度区带离心纯化、Triton X-100裂解、再纯化和氢氧化铝吸附、分装等工艺制备得到大流行流感病毒裂解疫苗。本发明在大流行流感疫苗(全病毒)的基础，通过采用二乙烯亚胺和辅料甲醛组合更彻底地灭活病毒，同时采用裂解剂裂解和新的纯化方法，去除副反应源——病毒内脂膜，最终能够以较高的浓缩效率和回收率制备得到杂质含量更少，HA含量更高的保持较高免疫原性的大流行流感病毒裂解疫苗，所述疫苗不含硫柳汞，接种更安全；接种人群更广泛，而且灭活疫苗更加安全、可靠。

主权项

一种大流行流感病毒裂解疫苗的制备方法,其包括NIBRG－14病毒的接种培养、灭活病毒、病毒液澄清和浓缩、层析纯化病毒、Triton X‑100裂解病毒、超滤膜再纯化、除菌过滤、氢氧化铝吸附、分装冻干制成疫苗成品的步骤，其中采用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒在20‑25℃作用6小时灭活病毒，所述甲醛的终浓度为1比4000，所述二乙烯亚胺的终浓度为0.02%。2、根据权利要求1的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：NIBRG－14病毒的接种培养按照如下步骤进行，将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10‑5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml／枚，将接种病毒的鸡胚放在37.5℃，相对湿度60%下培养，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。3、根据权利要求1的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒液澄清和浓缩包括滤网过滤、滤膜过滤，超滤和衡滤浓缩。4、根据权利要求3的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒液澄清和浓缩具体步骤如下：将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加 0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2，将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，即经10μm滤膜粗滤后，再经两次0.45μm滤膜过滤，最后用相对分子质量1000KD的膜进行超滤浓缩，0.01mol/L pH 7.2的 PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的 PB回收病毒液。5、根据权利要求1的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒纯化采用分子筛凝胶层析系统。6、根据权利要求5的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：分子筛凝胶层析系统为Amersham的BPG200．750；凝胶为Sepharose 4FF，凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体，层析柱凝胶装量为14L，使用的平衡盐溶液为0.01mol/L pH 7.2的PBS，流速为150ml/min，样品上样量为700ml。7、根据权利要求1的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：Triton X‑100裂解是用0.01mol/L pH7.2 的PBS将裂解剂Triton X‑100稀释至浓度为0.5%，与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温20‑25℃作用2小时。8、根据权利要求1的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：超滤膜再纯化选用截留分子量为100 kD的超滤膜,超滤缓冲液用0.01mol/L 、pH=7.2的PBS，进液压力在50psi左右，回流压力为0‑10psi，采用PBS超滤10倍体积，用于Triton X‑100去除工艺。