一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法及其用途

摘要

一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法及其用途，属于生物医药技术领域。以构建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆为基础，去除病毒结构蛋白基因prM和E而保留全部非结构蛋白的复制子表达载体PAC-JEV，并在结构蛋白基因C基因下游插入目的基因后将该重组复制子PAC-JEV-目的基因转染BHK-21，可以用于JEV基因与蛋白功能关系及基于复制子载体的疫苗的研究。

主权项

一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）将含有JEV疫苗株SA14‑14‑2的基因片段质粒pK‑JEV，以低拷贝质粒pACYC‑177为骨架，引入新的酶切位点（HindⅢ‑ EcoRⅠ‑ KpnⅠ‑SalⅠ‑XbaⅠ‑ XhoⅠ），将CMV启动子插入新引入的酶切位点HindⅢ‑ EcoRⅠ间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点间，称为pAC‑CMV‑CF2A质粒；再以pK‑JEV为模板，用NSⅠ‑F及NSⅠ‑R、NSⅡ‑F及NSⅡH‑R1/R2/R3分别扩增JEV非结构蛋白NSⅠ和NSⅡ+HDVRz，将NSⅠ保存于‑20℃，备用；2）利用XbaⅠ和XhoⅠ将NSⅡ连接到pBluescript SK2(+)上并称为pBlue‑ NSⅡ+HDVRz，以NheⅠ和XhoⅠ为酶切位点将polyA连接到pBlue‑ NSⅡ+HDVRz，连接产物鉴定正确后经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切再连接到pAC‑CMV‑CF2A上，将其称为pAC‑exJEV；3）最后利用SalⅠ和XbaⅠ将NSⅠ连接到pAC‑exJEV上，将最终的复制子载体称为pAC‑JEV，即得DNA复制子疫苗。