排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，通过阴沟肠杆菌抗体溶液制备和免疫磁珠溶液制备，将待测水样中用免疫磁珠溶液富集，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液，然后用DNA提取试剂盒提取DNA模板，再通过多对引物的PCR检测，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，则水样中含有阴沟肠杆菌；该方法水样中阴沟肠杆菌富集程度高，利于检测，检测灵敏，多对引物同时检测，准确性高。

主权项

排污口水体中阴沟肠杆菌的多重PCR检测方法，其特征在于步骤如下： a、阴沟肠杆菌抗体溶液制备：挑取阴沟肠杆菌单个菌落接种于由胰蛋白酶酶解的酪蛋白大豆液‑琼脂液体培养基中，震荡培养过夜，7000～8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水水洗1次，再用生理盐水悬浮，加入质量百分浓度为0.5%～1%的甲醛过夜；次日7000～8000转/分下离心5分钟，沉淀用生理盐水洗3次，并用生理盐水分别配成浓度为107～109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液和浓度为1010 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液，将浓度为107～109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，间隔一周，用浓度为107～109 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用浓度为1010 cfu /ml阴沟肠杆菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加强免疫，加强免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37℃下温育0.5h，4℃下3000转 / 分离心15min，得上清，该上清为阴沟肠杆菌抗体溶液；b、免疫磁珠溶液制备：取100～200μl羧基磁珠置于离心管中，加入500 μL活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，将离心管放置于磁分离架上，待纳米磁珠完全被吸附于离心管壁，移出管中液体，用活化缓冲液洗涤纳米磁珠一次，洗涤后在离心管中加入活化缓冲液500μl、碳二亚胺0.5mg和N‑羟基琥珀酰亚胺1mg，在漩涡振荡器上混合均匀，室温下活化20 min，移出管中液体，得到活化磁珠，用偶联缓冲液洗涤活化磁珠二次，洗涤后在离心管中加入浓度为6 mg/ml的上述阴沟肠杆菌抗体溶液15μl，室温下反应3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶联缓冲液洗涤免疫磁珠二次，然后加入含有质量百分浓度1％牛血清白蛋白的偶联缓冲液500μl封闭免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化缓冲液为pH为6.0含有吐温‑20的NaH2PO4 溶液，所述偶联缓冲液为pH为7.4含有吐温‑20的NaH2PO4 溶液，所述活化缓冲液和所述偶联缓冲液中，NaH2PO4浓度为0.01M，吐温‑20的质量百分浓度为0.05%；c、待测样品富集：取排污口水样2ml于试管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室温轻缓旋转振荡30min，移出试管中液体，用磷酸缓冲液洗涤免疫磁珠3～5次，洗涤后加入0.5ml无菌水，将试管置于磁性细胞分离架上磁性分离3min，取出免疫磁珠，得到阴沟肠杆菌富集的待检样品溶液；d、DNA模板制备：待检样品溶液用DNA提取试剂盒提取DNA，得到DNA模板，具体提取依DNA提取试剂盒说明书进行；e、PCR检测：30μl的PCR反应体系为：10×PCR 缓冲液2.5μl，浓度25mM的MgCl2液1.5μl，浓度10mM的dNTP液1.5μl，浓度5U/μl的T aq DNA 聚合酶0.2μl，浓度都为10μM的引物irp2‑F、irp2‑R、FhuA‑F、FhuA‑R、SodB‑F、SodB‑R、Slt‑F、Slt‑R各1.0μl，上述DNA模板2μl，余量为双蒸水；PCR反应条件为94°C变性5 min，94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸1min，35个循环，72°C延伸10 min；PCR反应产物用质量百分浓度1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四个目的基因片段，则排污口水体中含有阴沟肠杆菌，所述引物irp2‑F的核苷酸序列为：AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物irp2‑R的核苷酸序列为：AACTCCTGAT ACAGGTGGC，所述引物FhuA‑F的核苷酸序列为：CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA‑R的核苷酸序列为：TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB‑F的核苷酸序列为：ACCACCAGGC GTATGTCACT AA，所述引物SodB‑R的核苷酸序列为：TGCCGAAAGA TTTGGCGATT，所述引物Slt‑F的核苷酸序列为：CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物Slt‑R的核苷酸序列为：TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。