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小鼠卵巢表面上皮细胞体外自发恶性转化模型建立技术，其特征在于，包括以下步骤：a．小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶转化阶段步骤1）原代小鼠卵巢表面上皮细胞：首先在超净台下，取4只6 ‑ 8 周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400 IU/ml 青霉素、链霉素的PBS（1000 ml 双蒸水, NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 3.48 g , KH2PO4 0.2 g , PH为7.4）缓冲液中；然后用无菌的PBS溶液轻轻冲洗卵巢3次，剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜，将剥离后的卵巢放置在装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA, 37℃预热）的1.5 ml EP 管中，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中消化，为使卵巢表面充分接触胰酶，应尽量使卵巢分离开来； 30 min 后，从培养箱中取出1.5 ml EP 管，上下摇动10 次左右经，取出卵巢并将其转移到另一个装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA）的1.5 ml EP 管中进行第二次消化, 在原1.5 ml EP 管中加入完全培养基终止消化，将包含有上皮细胞的液体离心（1000 r/min,5 min），弃上层液，加入1 ml 完全培养基缓慢吹打6 ‑ 10 次，收集含小鼠卵巢表面上皮细胞的悬液，移入35 mm 培养皿，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中孵育；第二次消化的步骤与第一次相同；最后，在实验的第2 d 应尽量避免移动培养皿，利于细胞贴壁生长，同时能够维持细胞周围的微环境稳定, 在实验的第3 d 根据细胞生长情况换液, 细胞密度达80%时，使用免疫荧光法检测其上皮细胞标志物Pan‑keratin的表达，阳性率达95%，鹅卵石样立方上皮细胞达80%以上时，进行下述的长期传代培养； 步骤2）早期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数小于15代的细胞，形态多为鹅卵石立方样上皮细胞，细胞核规则椭圆形，按2：3比例传代，时间间隔5 ‑ 7 d，使用半量换液法，即一半新鲜DMED/F12完全培养基，一半培养皿中发黄的培养基，细胞的染色体数目多为40条；步骤3）中期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数在16至84代之间的细胞，形态为立方形与细长梭形细胞夹杂存在，出现较多多核细胞，核仁增多，按1：2比例传代；随代数增加，细胞的生长速度加快，35代后改用不加生长因子的DMED/F12培养基，60代后传代比例为1：5至1:8，时间间隔为3 ‑ 5 d；细胞的染色体数目多为二倍体或三倍体，平板克隆形成能力明显提高，但是还没有软琼脂克隆形成能力；步骤4）晚期传代的小鼠卵巢表面上皮细胞：是接种代数大于85的细胞，形态多呈细长梭形，按1：10比例传代，时间间隔为3 ‑ 5 d，使用含有10%胎牛血清的DMED/F12培养基；细胞的染色体数目多为超四倍体，具有软琼脂克隆形成能力；b．小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化鉴定步骤1）细胞转化灶：是由密集而重叠的细胞组成，在透光检查时，用肉眼均可见有大小不等的白色斑块“转化灶”；显微镜下观察，细胞转化后胞体增大，成多边形生长无方向性，失去接触抑制，向三维空间延伸排列，细胞相互重叠；在转化灶边缘，转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别明显；步骤2）染色体核型分析：正常的小鼠染色体核型为40XX(XY)，使用常规染色体制片技术Giemsa染色，观察已发生恶性转化的卵巢表面上皮细胞的染色体多为超四倍体；步骤3）软琼脂克隆形成：制备底层胶：用双蒸水配制出1.4%低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，置于40℃水浴锅中平衡温度45 min；将（2 × 高糖DMEM + 20% 胎牛血清 + 2% Insulin‑Transferrin‑ Selenium）在40℃水浴锅中均衡温度45 min；将等体积的上述两种液体混匀，以制备含0.7%琼脂胶；将1.5 ml的上述混合液缓缓注入35 mm培养皿中，避免气泡产生,等待1 h以使胶完全凝固；制备上层胶：将上述0.7%琼脂胶在37 ℃水浴锅中均衡温度45 min；在无菌超净台中将早期、中期和晚期的小鼠卵巢表面上皮细胞以及阳性对照人卵巢癌细胞株SKOV‑3细胞用胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA）消化，台盼蓝排染，血球计数板计数，用培养基调整体积使细胞数为105细胞/ml；将1 ml细胞悬液加入15 ml离心管中，然后加入3 ml完全培养基与3 ml的0.7% 琼脂胶；轻柔吹打混匀；在培养皿底层胶的上面缓缓注入1.5 ml上述混匀液，避免气泡产生，每组设定3个平行样，置于超净台中（室温25℃）90 min，待上层胶凝固后，在上层轻轻滴入500 μL DMED/F12完全培养基；将培养皿置于37℃、5% 二氧化碳的培养箱中培养，期间每隔3 d，补加0.5 mL DMED/F12完全培养基；培养10 d后，把平皿置于倒置显微镜下，计数克隆直径>15μm的克隆数；每组设定3个平行样，独立实验重复3次；软琼脂克隆形成率＝(克隆形成数/接种细胞数) х100%； 步骤4）体外恶性转化能力判断：与早期和中期小鼠卵巢表面上皮细胞相比较，晚期细胞的软琼脂克隆形成率明显增高，与阳性对照人卵巢癌细胞株SKOV‑3细胞相比较，虽然克隆形成率低，但是所形成克隆的体积明显偏大，多数直径是大于20μm的克隆，说明晚期的小鼠卵巢表面上皮细胞已发生体外恶性转化。 |
