胸苷酸合成酶在大肠杆菌中的高效表达

摘要

本发明为：胸苷酸合成酶在大肠杆菌中高效表达的新方法。TS是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶，在快速增殖的细胞中抑制TS活性可使DNA合成受阻，引起细胞死亡，多年来TS一直是肿瘤化学治疗的重要靶点之一，研究其酶学性质有助于开发新型抗癌药物。人类TS基因为真核基因，含有大量原核生物稀有密码子，传统的表达方法获得纯酶量少、操作量大。本发明采用分子生物学的方法、在不发生定点突变下，构建含有野生型人类胸苷酸合成酶基因的大肠杆菌表达质粒TS-pET-28b(+)，转入含有真核生物稀有密码子的菌株Rosetta(DE3)，通过发酵条件的优化，获得高效表达，因而本系统具有表达水平高、成本低等特点。

主权项

一种保藏号为CGMCC No.3920的基因工程菌TS‑pET‑28b(+)/Rosetta(DE3)的制备方法，其特征在于包括以下步骤：第一步引物的设计与合成以野生型人类TS cDNA为模板设计PCR引物，其中TS cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；PCR引物设计时，分别在5’端添加6聚组氨酸编码序列和内切酶Nde I识别序列，在3’端添加了内切酶Xho I的识别序列；上游引物：5’ATCAT ATGTA CCGCG CCATG CCTGT G‑3’‑(Nde I)；下游引物：5’‑GCCTC GAGAA CCCTA AACAGCCATT TCCAT TT‑3’‑(Xho I)；第二步PCR扩增人TS编码片段及其T/A克隆以SEQ ID NO：1所示野生型人类TS cDNA为模板，用上述的两条引物经PCR反应从cDNA中扩增出含有Nde I、Xho I酶切位点的、全长为971bp的野生型人类TS蛋白编码片段；扩增产物利用琼脂凝胶进行分离纯化，将胶回收得到的TS基因片段与克隆载体pMD18‑T连接，并将连接产物导入感受态DH5α，经在LB/Amp/X‑gal/IPTG平板上培养，挑取白斑菌落加入LB/Ampicillin培养基中过夜摇菌提取质粒，用PCR及NdeI、Xho I双酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆命名为TS‑pMD18‑T；第三步含有6聚组氨酸编码序列的人类胸苷酸合成酶大肠杆菌表达载体的构建按照常规的分子克隆步骤，将TS‑pMD18‑T经过限制性内切酶酶切下含有编码人类TS蛋白313个氨基酸残基的野生型目的基因，再进一步连接至大肠杆菌表达载体pET‑28b(+)中，所得重组表达质粒命名为TS‑pET‑28b(+)；将含野生型人类胸苷酸合成酶编码基因的重组表达质粒TS‑pET‑28b(+)导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，并筛选表达TS‑His的菌株，命名为TS‑pET‑28b(+)/Rosetta(DE3)。