一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺

摘要

本发明公开了一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺为交联剂，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，起到保护胶原纤维，改善脱细胞真皮对创面降解因子的耐受性，经过本发明改进工艺后制备的皮肤移植用脱细胞真皮材料，更适宜医学烧伤及整形专科应临床使用。

主权项

一种制备皮肤移植用脱细胞真皮材料的改进工艺：是在反复超低温冻融结合超声振荡工艺的基础上，以1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺为交联剂，通过向脱细胞真皮中导入透明质酸后修饰其胶原纤维，降低其降解率，具体工艺步骤如下：a.取3月龄中华香猪猪背部皮，经清洗、去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25‑0.35毫米中厚皮片备用；b.将皮片无菌塑封袋密封标记后置入‑80℃‑‑90℃超低温冰箱，冷冻6‑8小时后取出，40℃‑‑50℃温水复温，至皮片完全融化，低温冷冻及复温过程重复3次；c.将反复冻融处理过的皮片浸入3％‑5％‑的高渗氯化钠溶液中浸泡30‑40分钟后取出，用蒸馏水反复洗涤后备用；d.将蒸馏水反复洗涤后的皮片平铺放在网格状金属筐内架空的平面网格托层上，将网格状金属筐整体置入充满庆大霉素阴阳离子洗脱液的KQ‑250DB数控超声清洗器内，使皮片完全浸入庆大霉素阴阳离子洗脱液中，进行超声振荡洗涤72小时，超声振荡洗涤过程中每两小时上下颠倒更换金属筐朝向一次，每6小时更换一次洗脱液，当猪皮表皮层已与真皮层松脱后，用镊子将表皮剥除，经反复震荡洗涤72小时后充分脱除细胞；e.将KQ‑250DB数控超声清洗器内的庆大霉素阴阳离子洗脱液置换成庆大霉素蒸馏水进行超声振荡清洗脱除细胞后的皮片，振荡清洗过程中每4小时更换一次蒸馏水，振荡清洗72‑84小时后，使皮片内的洗脱液含量低于万分之一，超声振荡期间洗脱液及蒸馏水的温度控制在25～35℃；f.将步骤e.制备的皮片正反面分别以紫外线照射消毒，并使用碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，制备成用于皮肤移植脱细胞真皮材料，经装袋密封并标记后，以‑80℃‑‑90℃低温冷冻保存备用；g.将低温冷冻保存的脱细胞真皮材料取出后自然解冻复温后，去除包装，以稀碘伏及庆大霉素生理盐水浸泡2小时，取出以滤纸吸干水分后称重；h.用称重所得脱细胞真皮材料重量以公式：W透明质酸=W脱细胞真皮÷1000计算得到交联脱细胞真皮所需透明质透 明质酸重量；i.在室温下，配置0.05mol／l的MES缓冲液，用HCL溶液及NAOH溶液调PH到5.6备用，然后将步骤H计算所得配置所需的透明质酸钠晶体溶于配置好的MES缓冲液中，充分搅拌，需随配随用，使透明质酸钠浓度为2毫克／毫升；j.将交联剂EDC及N‑羟基琥珀酰亚氨晶体同溶于配置好的MES缓冲液中，使EDC浓度为0.8毫克／毫升，NHS浓度为0.48毫克／毫升，1：1混合透明质酸钠溶液及EDC／NHS缓冲液，室温下反应10分钟；终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，确保无EDC残留。将处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时，封口包装，标记日期、规格，放入低温冰箱备用。k.将脱细胞猪真皮基质浸入反应液中，加盖固定、密封后，置于DSHZ‑300多用途水浴恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动2小时，频率为60次／分，反应完成后弃去反应液，加入PBS缓冲液2毫升，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动30分钟，频率为60次／分，后弃去洗涤液，重复洗涤过程4次共计2小时，以终止透明质酸与胶原纤维蛋白的交联反应；l.终止反应后弃去容器中PBS缓冲液，加入含有4000U／L庆大霉素的浓度为4mol／l的NaCl溶液，置于恒温振荡器中在25℃恒温下轻微晃动24小时，频率为60次／分，每6小时换液1次，弃去洗涤液后以含有4000U／L庆大霉素的蒸馏水依上述条件洗涤24小时，每4小时换液1次，将水溶性的交联剂EDC充分洗脱，无EDC残留；m.将步骤m.处理后真皮以紫外线照射消毒，真皮正反面各照射1小时，以稀碘伏及4000U／L庆大霉素生理盐水溶液浸泡2小时后，得到脱细胞真皮材料，封口包装并标记日期及规格后，放入低温冰箱备用。