抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途

摘要

本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对肿瘤中异常高表达的AFP和STAT3基因的靶序列，构建了能在真核细胞中同时表达STAT3和AFP siRNA的质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP。本发明能高效、特异性地抑制肿瘤细胞的STAT3和AFP基因表达，可用于制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物。

主权项

抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以pGenesil1.5为载体，利用双靶标siRNA技术，在一个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用,是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质；所述的shRNA序列的两个反向重复序列分别是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互补序列；所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为：①5'‑GCAACAGATTGCCTGCATTGG‑3' ，起始于956位；②5'‑CAGGGAGACATTCATGAAC‑3'，起始于508位；所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为：5'‑CCAATGCAGGCAATCTGTTGC‑3'，5'‑GTTCATGAATGTCTCCCTG‑3'；STAT3、AFP基因shRNA表达框的loop序列分别为：5'‑GGCCGGCGCGC‑3'，5'‑CGCGCGCGGGCC‑3'；由以下方法制得：（1）        STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建a.第一轮PCR：以包含H1和U6启动子的质粒XM‑2P为模板，设计PCR引物，在3’引入PCR模板质粒XM‑2P的部分序列，用于扩增H1和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列；上游引物：P1‑FW: 5’‑GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC‑3’，下游引物：P1‑RV: 5’‑CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC‑3’；b.第二轮PCR：以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”及限制性内切酶HindIII 的酶切位点AAGCTT、BamHI的酶切位点GGATCC，为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”：上游引物：P2‑FW: 5’‑ AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC ‑3’，下游引物：P2‑RV: 5’‑ ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT ‑3’；c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII‑ ‑shRNA1‑ H1启动子—U6启动子‑shRNA2‑ BamHI；（2）    将步骤（1）所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesil1.5同时用HindIII、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5α大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；得到抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒pGenesil1.5‑STAT3‑AFP；（3）    质粒的鉴定：将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIII、BamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片段测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesil1.5质粒中。