芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法

摘要

本发明公开了一种芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法，根据芜菁花叶病毒核酸序列，设计了一套特异引物（F3、B3、FIP、BIP，如SEQIDNO.1～4所示）样品提取总RNA后，进行LAMP反应，反应产物经电泳或者荧光染料的方法实现芜菁花叶病毒的检测。本发明的方法，对TuMV的检测特异性强，具有快速、灵敏、稳定、高效，仪器要求简易，操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。

主权项

芜菁花叶病毒的逆转录环介导等温扩增快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）引物设计：根据NCBI上已报道的芜菁花叶病毒核酸序列，设计特异引物，引物序列如下：F3：TGCCACGATATGGTCTTC；如SEQIDNO.1所示；B3：TGTTCTCTACCGTTGTACC；如SEQIDNO.2所示；FIP:CACGTATTGGAGTTCTAGAAGTCAT‑AGCGCAATTTAACCGACA；如SEQIDNO.3所示；BIP:CGAGAGAGGCACACATCCAG‑AACGTTTCCATCCAAGCC；如SEQIDNO.4所示；（2）植物总RNA提取：取0.1g新鲜植物叶片在液氮中研磨至粉末，采用RNAsimpleTotalRNAKit提取样品总RNA，通过抽提RNA产物加入DEPC‑ddH2O溶液，‑80℃保存备用；（3）RT‑LAMP反应：反应体系(25μL)如下：10×Thermopolbuffer2.5μL（20mMTris‑HCl，10mMKCl，2MmMgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1%TritonX‑100），引物（F3和B3）0.2μM，引物（FIP和BIP）1.0μM，dNTPs1.0mM，MgCl24mM，200U/μLM‑MLV1μL，BstDNApolymerase（NEB）1.5μL，模板RNA2.0μL；反应条件：63℃恒温1h；80℃5min；（4）检测：电泳检测：取10μL产物经1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和155V电压条件下电泳25min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在感染芜菁花叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带；或：荧光染料检测：LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBRGreenI(1∶1000)2.5μl，5min后察结果，感染芜菁花叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。