一种甲型肝炎病毒的提纯方法

摘要

本发明提供了一种甲型肝炎病毒的提纯方法，以甲型肝炎病毒细胞培养液为原料，经超声破碎、离心除细胞碎片、氯仿抽提、超滤浓缩、疏水层析、检测与收集等工艺流程后完成对甲型肝炎病毒的提纯工艺。以它为原料制备的甲型肝炎灭活疫苗的纯度和效价高，工艺简单易放大，使用安全可靠。

主权项

一种甲型肝炎病毒的提纯方法，包括以下步骤：1）甲型肝炎病毒细胞培养液超声破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液，所述离心条件为3500r/min，离心10min；其中，所述超声破碎是将抗原滴度达到1：512的甲型肝炎病毒细胞培养液在冰浴条件下超声破碎，使用的超声破碎仪功率额定功率为1500w，输出功率为1200w，破碎次数为4次，使细胞破碎率达99％以上，所述甲型肝炎病毒为甲肝病毒SH毒株，保藏号为CGMCC No.4501；2）氯仿抽提上清液，得到粗制病毒液；所述氯仿抽提是将氯仿按体积比为1:3加入上清液振摇，然后3500r/min离心后吸取上层水相，如此重复抽提5次；将蛋白相和氯仿再用抽提缓冲液抽提并吸取上层水相，合并上层水相得到粗制病毒液；所述的抽提缓冲液为6.2mM PBS；3）将粗制病毒液超滤浓缩，缓冲盐溶液洗脱超滤膜，超滤浓缩的倍数为10倍，超滤膜的截留分子量为50KD；缓冲盐溶液为2mol/L的PBS溶液，pH7.2；4）疏水层析纯化浓缩病毒液；所述层析为：每次上样量为1000ml，上样缓冲液为2mol/L PBS，pH7.2，洗脱缓冲液为0.5mol/L PBS，pH7.2，流速为15ml/min；5）用280nm波长对平衡好的购自GE公司的XK50/30柱上洗脱的病毒液进行检测，观测电导，根据电导观测结果，从电导30开始收集病毒液，一直收集到电导降到2.4，合并收集的病毒液即完成提纯工艺过程；将收集到的甲型肝炎病毒液按其总体积的1/4000加入甲醛，再放37℃恒温室内，旋转12天即完成灭活过程；纯化甲肝病毒液灭活后甲肝病毒抗原效价为6400EU/ml，用2mM PBS、pH7.2、稀释10倍至甲肝病毒抗原效价640EU/ml，经无菌、效力、异常毒性、细菌 内毒素检查后即为甲型肝炎病毒疫苗制品。