荞麦AFLP反应体系的建立方法及其应用

摘要

本发明提供了一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法。上述荞麦AFLP反应体系的建立方法，通过改进AFLP关键步骤的反应条件，适当地增加了抽提的次数，既将反应液中的杂质去除干净，又减少荞麦DNA机械断裂，提高DNA提取的质量；设置的酶切时间可充分地将荞麦基因组DNA进行酶切；设置的Mg2+浓度既可提高产物特异性DNA的产出率，又避免了非特异性DNA扩增，建立了可靠性好、重复性强、可信度高、方便快速的适用于荞麦的反应体系，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。

主权项

一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法，包括如下步骤：将荞麦叶片加入CTAB提取液反应0.5～2小时，抽提，得到模板DNA;将所述模板DNA与内切酶体系混合，在35～38℃下反应1～9小时，得到酶切后的DNA；其中，所述模板DNA与所述内切酶体系的容量比为1～2：9～8，所述模板DNA的OD260‑280值为1.8～2.0；将所述酶切后的DNA与连接体系混合，在16～22℃下反应3～10小时，得到连接后的DNA；其中，所述酶切后的DNA与所述连接体系的容量比为1～2:4～5；将所述连接后的DNA与预扩增体系混合，进行第一次PCR反应，得到预扩增的DNA；其中，所述连接后的DNA与所述预扩增体系的容量比为3～5:15～17；将所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系混合，进行第二次PCR反应，得到扩增后的特异性DNA；其中，所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系的容量比为3～5:15～17；其中，所述选择性扩增体系包含浓度为0.2～1.0mmol/L的第一选择性引物和浓度为0.2～1.0mmol/L的第二选择性引物、浓度为0～3.0mmol/L的含Mg2+盐溶液；其中，所述第一选择性引物、第二选择性引物与含Mg2+盐溶液的容量比为4～6：4～6:5～15。