一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法

摘要

一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法，该假病毒颗粒是由MS2噬菌体外壳蛋白包裹诺如病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体，RNA-蛋白复合体的形状为球状；设计并人工合成引物通过PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒pET-28b(+)上得到重组质粒pET-28b/MS2，将所得重组质粒pET-28b/MS2与NV片段连接得到pET-28b/MS2/NV重组质粒，将所得pET-28b/MS2/NV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用聚乙二醇法沉淀病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒。本发明的假病毒颗粒可作为RT-PCR检测的标准品和质控品，无传染性，安全可靠、稳定性好，具有耐核糖核酸酶的特点。

主权项

一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：其具体制备步骤为：步骤一、pET‑28b/MS2重组质粒的构建:1)设计PCR扩增MS2噬菌体的MS2基因的引物，并进行人工合成，其序列分别为：上游引物：5’‑ATCCATGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCG‑3’，下游引物：5’‑GCGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT‑3’，下划线所指为上下游引物分别引入的NcoⅠ和BamH 酶切位点；然后通过RT‑PCR的方法扩增出MS2基因，其碱基序列如SEQ ID NO：3；                                 2)采用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ分别双酶切MS2基因和质粒pET‑28b(+)，纯化后进行连接，得到连接产物；3)将上述步骤2）所得到的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单菌落进行 PCR和双酶切鉴定，确保重组质粒pET‑28b/MS2构建的正确性,‑20℃保存鉴定正确的重组质粒pET‑28b/MS2；步骤二、pET‑28b/MS2/NV重组质粒的构建:1) 人工合成诺如病毒NV基因片段的正义链NV1和反义链NV2，其碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5； 分别在正义链的5’端加入BamHⅠ酶切位点，在反义链的5’端加入HindⅢ酶切位点；取等摩尔量的合成后的正义链NV1和反义链NV2加入同一个PCR管，混合均匀后置于94℃水浴10min，冷却至室温，使其退火为双链，即合成了NV基因片段；2)采用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII分别双酶切重组质粒 pET‑28b/MS2和上述步骤1）所制备的NV基因片段，纯化后进行连接，得到连接产物；3)上述步骤2）所制备的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单菌落提取重组质粒，分别进行PCR鉴定和三酶切鉴定，以确认pET‑28b/MS2/NV重组质粒正确构建，并获得含有pET‑28b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落；步骤三、诱导表达与纯化将上述步骤二鉴定正确含有pET‑28b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落，重新涂布于含卡那霉素的LB平板，培养后挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至A600nm的检测值为0.5～1.0时，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，使其终浓度为0.4mmol/L，继续培养5h，离心收集菌体；将菌体悬浮于TE溶液中，加入溶菌酶，使其终浓度为10mg/L，室温放置20min，离心去除沉淀，向上清液加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I，使两者终浓度均为1mg/L，37oC水浴1小时溶解DNA和RNA，然后采用聚乙二醇沉淀法进行操作，提取出的病毒样颗粒物，即为本发明含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒，将其溶解于TE缓冲液，置于4℃储存。