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在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1）乙醇氧化酶基因的扩增：根据毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物,上游引物：5’‑CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT‑3’，下游引物：5’‑ATTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC‑3，在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA； 2）重组表达载体的构建：将目的基因定向克隆进同样经EcoRI和Not I双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K‑AOX‑HIS，将该重组表达载体pPIC9K‑AOX‑HIS转化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA‑BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定； 3）将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中：在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3‑5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3‑6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时制备毕赤酵母GS115感受态，取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1‑3μg上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于28‑30℃条件下培养2‑4天； 4）多拷贝转化子的筛选：将最小葡萄糖培养基平板上的转化菌落点在含抗生素G418的酵母膏胨葡萄糖培养基选择平板上，筛选出抗生素G418浓度为2.0‑4.0mg/ml的菌株； 5）重组菌株的诱导表达：将步骤4）筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中,在200转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为l:100,在200转/分钟转速、30℃下培养24小时；在1500‑3000转/分钟转速、室温下离心5分钟,收获酵母沉淀,用体积浓度1％‑5％甲醇的缓冲复合甲醇培养基或YPM培养基悬浮酵母,使菌体细胞浓度OD600=1‑2，每隔24小时添加体积浓度1％‑5％的甲醇，诱导表达48‑96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液，所述YPM培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10‑50g/L碳源，pH5.0‑9.0，碳源为麦芽糖； 6）胞外重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5）所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33%丙酮在‑20℃下沉淀，然后,在4℃、13000转/分钟转速下离心，得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4℃、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡,再用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白； 7）胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5）中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬，然后用超声波进行破碎，超声波破碎的溶液离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡,用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱；用5倍柱体积的上样缓冲液平衡凝胶层析柱，然后加入上述洗脱液并使其在柱内平衡,用上样缓冲液对凝胶层析进行洗脱，得到纯化的胞内重组乙醇氧化酶蛋白。 |
