一种创建甘蓝型油菜突变体的方法

摘要

本发明是一种创建甘蓝型油菜突变体的方法，包括如下步骤：有性杂交、幼胚抢救、快繁继代、染色体加倍和变异筛选。本发明的方法与物理辐射诱变、化学诱变及航空诱变育种方法相比，该技术属于环境友好型，对实验操作人员也不会造成身体损伤，该技术准入门槛低，普通的实验室都能够完成，成本低廉。

主权项

一种创建甘蓝型油菜突变体的方法，其特征在于包括如下步骤：a.有性杂交以白菜型油菜和甘蓝为父母本，分别进行正反交，于每蕾开花前1‑3天进行剥蕾去雄，去雄后授粉一次，次日重复授粉一次；b.幼胚抢救授粉10天后，每天剥开角果在体式显微镜下观察胚珠发育状态和幼胚发育进程，找准幼胚凋亡临界期；在幼胚凋亡前2‑3天取回角果用84消毒液灭菌15分钟，再用无菌水清洗三次后将角果放于无菌滤纸上剥出幼胚种于固体培养基，所述的固体培养基为成分为MS基本培养基+1.2mg/L6‑BA+0.25mg/LNAA；c.快繁继代在上述步骤a中的固体培养基中进行快繁，将一颗杂种苗增殖为3个以上的拷贝，进行MS和MS+1.5mg/L6‑BA+0.25mg/LNAA两种培养基交替培养继代；d.染色体加倍将小苗转入添加有100mg/L秋水仙素的MS培养基中培养，当幼苗的顶端明显变粗时停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗；e.变异筛选从创建的异源四倍体新型的甘蓝型油菜第一代开始，对其植株形态、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期观察，找出变异植株；用AFLP分子标记检测新型甘蓝型油菜基因组水平变异情况；利用5U EcoR I和2U Mse I限制性内切酶在37℃水浴酶切DNA，酶切片段两端连接人工接头E‑F:5'‑CTCGTAGACTGCGTACC‑3'、E‑R:5'‑AATTGGTACGCAGTC‑3'和M‑F:5'‑GACGATGA GTCCTG AG‑3'、M‑R:5'‑TACTCAGGACTCATC‑3'，用预扩增引物扩增连接产物，将预扩产物稀释后利用选择性扩增引物进行扩增， 筛选出新型甘蓝油菜突变体。