一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法

摘要

一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，涉及一种分析厌氧氨氧化菌群的方法。是要解决现有的分析厌氧氨氧化菌群的方法工作量大，费用高，不能实现厌氧氨氧化菌的快速分析的问题。方法：一、提取待分析样品的DNA；二、特异性PCR扩增；三、限制性内切酶酶切；四、酶切产物纯化；五、毛细管电泳；六、毛细管电泳结果分析，即获得厌氧氨氧化菌群分析结果。本发明方法无需克隆、测序，直接通过对酶切后末端片段长度的分析，即可完成对样品中厌氧氨氧化菌群的快速分析，减小了工作量，降低了成本。本发明用于厌氧氨氧化菌群的快速分析。

主权项

1.一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，其特征在于快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，按以下步骤进行：一、使用试剂盒提取待分析样品的DNA；二、特异性PCR扩增：以样品的DNA为模板，以Pla46F和630R为引物，进行第一次PCR扩增，获得扩增产物A，将扩增产物A经DNA纯化试剂盒纯化，获得纯化产物，然后以纯化产物为模板，以AMX368F和AMX820R为引物，进行第二次PCR扩增，获得扩增产物B；其中，所述的AMX368F引物的5’端进行荧光标记；三、限制性内切酶酶切：将扩增产物B经1U的绿豆核酸酶消化30min，消化后的扩增产物B采用PCR产物纯化试剂盒纯化，然后使用MspI和RsaI对纯化的扩增产物B进行双酶切，获得酶切产物；四、酶切产物纯化：向酶切产物中加入1μL3mol/L、pH为5.2的NaAc溶液和20μL-20℃、体积浓度为96％的乙醇溶液，然后于10000rpm离心，弃上清，向沉淀中加入体积浓度为70％的乙醇溶液清洗，然后于10000rpm离心，取沉淀，干燥后加入5μL灭菌超纯水溶解沉淀；五、毛细管电泳：将1μL步骤四中溶解的沉淀、9μL甲酰胺和0.25μL DNA分子量内标-500混匀后，用DNA测序仪进行毛细管电泳，电泳程序：①变性，90℃，120sec；②进样，2.0kV，30sec；③分离，5.0kV，60℃，60min，电泳结果即为酶切后末端片段的长度；六、毛细管电泳结果分析：依据下述对应关系，将DNA测序仪获得的电泳结果数据采用GeneMapper4.0进行分析，即获得厌氧氨氧化菌群分析结果；其中步骤二中引物Pla46F为5’-GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R为5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’，引物AMX368F为5’-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物AMX820R为5’-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。