转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心ELISA定量检测方法

摘要

本发明涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，该检测方法是以体外条件下制备NPT II蛋白为免疫原，制备兔抗NPT II多克隆抗体为包被抗体，鼠抗NPT II单克隆抗体作为捕获抗体，建立并优化了双抗体夹心ELISA方法，以系列含量的NPT II蛋白作为标准，建立标准曲线，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：(1)NPT II基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性和稳定性，操作简单，适用于检测转基因作物中NPT II含量。

主权项

转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)NPTII基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系：①用0.1M的碳酸盐缓冲液作为抗原包被液将兔多抗体稀释至1：2000；100μL／孔包被ELISA板，4℃过夜；②用含0.05％Tween20的PBST溶液洗涤3次，每孔加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200μL，37℃封闭1h；③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，100μL／孔，同时用阴性血清作对照，37℃反应1h；④3次洗涤后加入100μL单抗(1：2500)，37℃反应1h；⑤用PBST洗涤3次，加入1：5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37℃反应1h，PBST洗涤3次，最后加入100μL可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4终止反应，利用酶标仪在450nm下测定吸光值，以抗原浓度为横坐标，以A／A0(A为标准蛋白吸光度，A0为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中 NPTII蛋白浓度。