油菜饼抗菌肽

摘要

本发明提供了一种新的对饲料中的霉菌有很好抑制作用的抗菌肽。该抗菌肽来源于油菜饼，其抑菌活性较高、分子量小、稳定性强、安全无毒，在饲料防腐试验中显示出比单一化学防霉剂更好的抑菌效果。本发明还提供了油菜饼抗菌肽的分离纯化方法、稳定性测试方法、动物急性毒性试验方法以及提供一种防止饲料中霉菌的应用方法。

主权项

一种油菜饼抗菌肽的分离纯化方法及稳定性、安全性和活性的测定方法，其特征是将油菜饼粉碎后溶于缓冲液中制备蛋白粗提液，再通过硫酸铵沉淀粗蛋白、粗蛋白脱盐、分子筛柱层析和高效液相色谱纯化、冷冻干燥一系列分离纯化操作，得到纯化后的油菜饼抗菌肽；同时检测抗菌肽的抗菌活性、热稳定性、酸碱稳定性和安全性，并检验抗菌肽对饲料中霉菌的抑制效果；步骤为：1)培养基制备：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min；2)抗真菌活性检验：①孢子悬液的制备：取长满已形成分生孢子的真菌菌落PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅动洗脱孢子；然后将该洗脱液用4层无菌纱布过滤，除去菌丝，加入适量无菌水制成3～5×104个孢子/mL的孢子悬液，置4℃条件下保存；供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉；②打孔法：制作PDA平板，吸取100μL供试菌株的孢子悬液，无菌操作，均匀涂布到平板上，晾干；用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔，然后加入样品或无菌水至平满，正面放置，28℃培养箱培养5d，测量抑菌圈直径；3)油菜饼抗菌肽的分离纯化：①油菜饼蛋白粗提液的制备：将40g油菜饼磨碎，加200mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液，4℃放置12h后，在4℃，4000r/min下离心30min，取上清液；②硫酸铵沉淀粗蛋白：上清液用饱和度为60±5％的硫酸铵沉淀，4℃下放置过夜，然后在4℃，14000r/min下离心20min，取沉淀，用1mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液溶解；③脱盐：将粗提液放入透析袋中，透析液选用0.05mol/L的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液，每隔2小时换一次透析液；④分子筛柱层析：选取Sephadex G‑100为填料，取提取液上样，用0.05mol/L的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液洗脱，流速0.15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的OD280值，并测试每管洗脱液的抑菌活性；⑤高效液相色谱法纯化：对分子筛柱层析中具有抑菌效果的收集液进一步纯化，检测各峰洗脱液的抑菌活性，收集抗菌活性部分；⑥分离液浓缩：将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0.05mol/L的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液溶解备用；4)油菜饼抗菌肽的活性测定：①将真菌接种在PDA平板上，在28℃下培养三天，让其形成成熟的孢子，供试菌株为玉米赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉；②在无菌操作下用接种针勾取少量孢子混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入200mL 50℃的已加入了100μg/mL氨苄青霉素的PDA培养基中，立即混匀倒板，冷却待用；③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔，加样品至平板，正面放置，在28℃培养箱中培养5d，然后测量抑菌圈直径； 5)油菜饼抗菌肽的分子大小测定：采用分离小肽的Tricine‑SDS‑PAGE测定，分离胶浓度4％，浓缩胶浓度15％，样品分别添加含巯基乙醇的还原性样品缓冲液和不含巯基乙醇的非还原性样品缓冲液，在沸水中煮5‑10分钟，冷却离心后取20μL上样；6)油菜饼抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性检测：①热稳定性检测：将抗菌肽分离液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃下分别处理15min，以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，测定其抑菌圈直径，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性；②酸碱稳定性检测：将抗菌肽分离液5mL用1mol/L HCl调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗菌肽分离液用1mol/L NaOH调整pH为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液pH 8作为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其酸碱稳定性；7)扫描电镜观察油菜饼抗菌肽对真菌的抑制作用：在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果，加入经高效液相色谱法纯化和分离液浓缩后的油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基和后者抑菌圈内的培养基，进行电镜观察；8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验：选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20±2g；将实验动物随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组，雌雄分开喂养；按小鼠每10克体重灌胃0.4mL 0.8g/mL经高效液相色谱法纯化和分离液浓缩后的油菜饼抗菌肽提取液，一日内给药一次，给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察；9)油菜饼抗菌肽对饲料中霉菌抑制作用的检验：①抑菌活性试验：采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质‑‑油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％定量地加到定量的已溶化的霉菌培养基中混匀，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种柑橘绿霉，黑曲霉，玉米赤霉、黄曲霉测试菌株；由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试验时它的添加量增加为正常使用量的250倍；同时设置空白组，置于28℃恒温恒湿箱内培养，观察霉菌的生长情况；抑菌活力(％)＝(对照菌盘扩展直径‑含抗菌物质菌盘扩展直径)×100％/对照菌盘扩展直径；②饲料防霉实验：油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％的添加量添加到粉料中，并设空白组，上述各成分分别进行强化试验和常规试验；强化试验：该方法是提高饲料水分含量，在高温、高湿的恶化环境中促使饲料尽快发霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果；在18％含水量的粉料中按设计的比例添加防霉物质，置于36℃，相对湿度95％以上的培养箱中培养；常规试验：在自然水分为12.58％的正常粉料饲料中按设计的比例添加防霉物质，同时设置空白组，在25℃～30℃，空气相对湿度为80％的自然环境下储放，各试验样品采用独立包 装，便于取样；定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况；③测定方法：霉菌菌落总数的测定：按GB/T 13092‑2006饲料中霉菌总数的测定方法测定；水分的测定：按GB/T 6435‑1986饲料水分的测定方法测定。