一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法

摘要

一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，涉及一种检测旋毛虫和猪囊尾蚴的方法。是要解决目前诊断食源性寄生虫的方法只能检测一种虫体的问题。方法：一、设计旋毛虫和猪囊尾蚴特异性引物，并采用生物素标记；二、样品处理；三、双重PCR扩增；四、探针的修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蚴Cc基因探针耦联；六、配制微球工作液；七、配制显色液；八、将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，杂交，读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的检测。本发明方法用于检测旋毛虫和猪囊尾蚴。

主权项

1.一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，其特征在于检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，按以下步骤进行：一、设计旋毛虫Ts基因特异性引物和猪囊尾蚴Cc特异性引物，并对每对引物上游5′端均采用生物素标记，引物序列如下：旋毛虫Ts基因特异性引物：TsP1：5’-Biotin-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3’，TsP2：5’-CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG-3’，猪囊尾蚴Cc特异性引物：CcP3：5’-Biotin-AGCGACGAGACGGGCATAC-3’，CcP4：5’-CGCTGCTGTTGACTGATGATG-3’二、样品处理：用DNA提取试剂盒提取待检样品的基因组DNA，作为PCR扩增模板；三、双重PCR扩增：以步骤二获得的基因组DNA为模板，用步骤一的引物TsP1、TsP2、CcP3和CcP4进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；四、探针的修饰：设计旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蚴Cc基因探针，在旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蚴Cc基因探针的5′端分别加11个T的连接臂，并进行氨基化修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000～50000个/μL的微球液A，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蚴Cc基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000～50000个/μL的微球液B；六、配制微球工作液：向300μL1.5×TMAC杂交液中依次加入1μL微球液A和1μL微球液B，混合均匀，即为微球工作液；七、配制显色液：用1×TMAC杂交液与SA-PE混合均匀，配制成10μg/mL的显色液；八、设置反应管和阴性对照管，向反应管中依次加入20μL的微球工作液、3μL步骤二获得的PCR扩增产物和7μL1×TE Buffer，向阴性对照管中加入20μL的微球工作液和10μL1×TE Buffer，用移液枪混合均匀；然后将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，经95℃变性5min，再经50℃杂交20min，然后向每管内加入80μL显色液，混合均匀，将反应管和阴性对照管再次置于PCR仪中，50℃杂交20min，杂交结束后将管放入Luminex100液体悬浮点阵检测仪的铜板中进行读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的检测；其中步骤四中旋毛虫Ts基因探针Tsp为5’-CCAACCAGCGATTCGCCGAAGT-3’，猪囊尾蚴Cc基因探针Ccp为5’-CACGAGCTTGAGGCAGACTAGGCACC-3’；其中，步骤三中双重PCR扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：PCR扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。