一种根癌农杆菌介导的大麦叶基转化方法

摘要

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的以大麦幼苗叶基诱导愈伤获得转基因植物的方法。本发明的要点是，以大麦叶基为外植体，诱导愈伤组织，通过农杆菌介导的遗传转化方法，利用Bar基因作为筛选基因，以除草剂草铵膦作为选择剂，对转化后的愈伤组织及分化植株进行筛选，经PCR和Southern杂交分析，证实外源基因已整合到大麦基因组中，获得了转基因大麦植株，与现有技术相比，本发明的转基因的外植体(愈伤组织)可周年供应；与经典的以幼胚为受体的转化方法相比，获得受体的时间从150天缩短到3天，克服了幼胚取材时间限制；与茎尖转化方法相比，本发明对技术要求降低，操作简单。

主权项

一种获得转基因大麦植物的方法，其步骤包括转化受体的制备，农杆菌介导的遗传转化和转基因植物的筛选鉴定，其特征在于：将大麦籽粒萌发获得幼苗，以叶基为外植体诱导愈伤，以农杆菌介导转化愈伤组织，经诱导筛选、分化筛选和生根筛选后获得转基因大麦植株，对获得的抗性植株进行PCR和Southern杂交并确定其拷贝数，其制备步骤如下：(1)将表达载体PMBL‑9通过电击转化农杆菌GV3101，用于大麦的遗传转化；(2)剥取大麦成熟胚，在成熟胚萌发培养基上培养3d，切取幼苗的叶基切段，然后将该切段纵切成两部分置于诱导培养基上诱导出愈伤组织，以该愈伤组织作为农杆菌转化的受体；(3)将步骤(2)叶基切段诱导出的愈伤组织通过高渗培养基培养4h后，与步骤(1)中含有PMBL9表达载体的农杆菌浸染和共培养，将共培后的叶基愈伤组织依次转移到诱导筛选培养基、分化筛选培养基和生根筛选培养基上，筛选获得侯选转基因植株；(4)将获得的候选转基因植株移栽成苗，经PCR检测侯选转基因植株，鉴定获得阳性转基因植株，收获种子种植T1代；(5)用Southern blot方法杂交鉴定T1代转基因植株，以重复验证获得的转基因植株并确定外源基因拷贝数；其中：步骤(1)所述的成熟胚萌发培养基的配方：1900mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8；步骤(1)所述的诱导培养基按以下配方：诱导培养基：以MS培养基为基本培养基，附加2.0mg/L2，4‑D，pH5.8；步骤(3)所述的高渗培养基按以下配方：高渗培养基：以MS培养基为基本培养基，附加0.4mol/L甘露醇和2.0mg/L2，4‑D，pH5.8；步骤(3)所述的培养基按以下配方：浸染培养基：190mg/L KNO3，165mg/L NH4NO3，17mg/L KH2PO4，37mg/LMgSO4·7H2O，44mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/L VB5，200mg/L L‑脯氨酸，100mg/L水解酪蛋白，100mg/L Vc，1.95g/L MES(吗啉乙磺酸)，30g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，200μL/L Silwet L‑77(Lehle seeds，USA)，0.5g/L谷氨酰胺，2，4‑D2.0mg/L，pH5.2，抽滤灭菌，使用时加1‰(v/v)经抽滤灭菌的200mmol/L的乙酰丁香酮；共培养培养基：190mg/L KNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，1.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/L VB1，0.5mg/L VB6，0.5mg/L VB5，0.69g/L L‑脯氨酸，1g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2.0mg/L2，4‑D，6g/L琼脂粉，pH5.2，使用前加1‰(v/v)经抽滤灭菌的200mmol/L乙酰丁香酮和500mg/L头孢霉素；诱导筛选培养基：以MS培养基为基本培养基，附加2.0mg/L2，4‑D，5mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素，pH5.8；分化筛选培养基：以MS培养基为基本培养基，附加0.5mg/L6‑BA，0.5mg/L KT，5mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素，pH5.8；生根筛选培养基：1/2MS培养基，附加3mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素，pH5.8；其中步骤(1)所述的具体步骤如下：1)大麦颖果灭菌：去掉大麦外面的颖壳，用70％酒精浸泡2min，0.1％升汞浸泡15min，用无菌水浸洗3‑4次，每次3～5min，室温下放置5～10h，在超净工作台内倒掉灭菌水，剥取完整的胚，将盾片向下，放置在MS培养基上，于25℃，黑暗下培养3d；2)叶基外植体制备：用解剖刀切取萌发3d的幼苗1mm叶基切段，然后将切段纵切成两半，放置在诱导培养基上，黑暗培养，培养温度为25℃，20d继代到新的诱导培养基上，继续培养7d左右。其中步骤(3)所述的具体步骤如下：1)根癌农杆菌扩大培养：将保存的含有PMBL‑9表达载体的农杆菌菌液1mL接种于50mL的附加100mg/L利福平，100mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，2mmol/L MgSO4的YEB培养基上，在28℃，200r/min暗培养至OD600＝0.8，然后于4℃，5000r/min下离心，收集菌体，浸染液重悬至OD600＝0.6，即为农杆菌重悬液，2)将培养27d的幼胚愈伤组织转到高渗培养基上培养4h，将通过高渗培养基培养后的 愈伤组织转移到农杆菌重悬液中，放置于100r/min的脱色摇床上30min进行转化，每次转化500～600个愈伤，期间辅助采用超声波和真空渗入处理，超声波处理方法为：将浸泡在农杆菌重悬液中的愈伤置于超声波清洗仪中处理20s，频率为5kHz；真空渗入处理：将浸泡在农杆菌重悬液中的愈伤组织置于真空泵中，待真空度升至80kPa时保持15min；3)转化后将愈伤组织转到带有滤纸的培养皿中，在超净工作台上吹干，然后将吹干后的愈伤组织转移到共培培养基上，在黑暗，25℃条件下共培养2d；4)洗菌：将共培养后的愈伤组织转到三角瓶中，加入含500mg/L头孢霉素的无菌水的抑菌液，浸过愈伤组织，放置在脱色摇床上100r/min，30min，然后再用抑菌液冲洗，直到液体澄清为止，随后将愈伤组织转移到带有滤纸的培养皿中，置于超净台上30min吹干，将吹干的愈伤组织转移到恢复培养基上，在黑暗，25℃条件下恢复7d；5)愈伤组织筛选及转基因植株再生诱导筛选培养：将愈伤组织转移到含有5mg/L草铵膦的诱导筛选培养基上，诱导筛选培养15～20d，诱导筛选后，将愈伤组织移至分化筛选培养基上，连续分化筛选两轮，每轮15～20d，至抗性愈伤组织上分化出幼苗；生根筛选培养：将分化的幼苗转移至生根筛选培养基上，连续筛选两轮，每轮15～20d，至抗性苗生长出根；再生植株的春化处理和栽培：将生长到3叶期的幼苗转移至不含筛选压的生根壮苗培养基上，待诱导出新根后，将其放置在4℃下进行春化处理15d，最后移栽到温室土壤中，在16h/d日光灯光照，光照强度为9000Lux，19℃条件下生长至种子成熟；步骤(4)所述的PCR鉴定步骤如下：用CTAB法提取T0代转基因大麦株系的基因组DNA，以Ubi‑1启动子序列为模板设计引物，扩增得到495bp片段，引物序列如下所示：正向引物UbiF：5’‑CGGTAGTTCTACTTCTGTTC‑3’，反向引物UbiR：5’‑CATCTCTGTATATGCATCAG‑3’；所述扩增片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。