利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法

摘要

本发明涉及植物细胞培养技术，具体的说是一种利用三尖杉液体悬浮培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法。将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入终浓度为10～2000μM的诱导剂和50～200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。本发明为生物合成方法，方法稳定，环境友好；产物完全被吸附到吸附剂上，大大简化了分离纯化的操作流程，不仅降低了成本，而且易于实现工业化生产。同时，本发明合成了包括一个新的化合物在内的7个松香烷二萜类化合物。松香烷二萜类化合物具有良好的生物活性，是一类重要的先导化合物，该技术具有重要的商业应用前景。

主权项

利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法，其特征在于：将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入终浓度为10～2000μM的诱导剂和50～200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子；继续培养7～14天后，分别收获细胞和吸附剂；第一次提取：室温下，将真空抽滤后的吸附剂先用极性或中等极性有机溶剂提取2～5次；合并提取液，过滤，旋转蒸干；第二次提取：在蒸干的粗提物中加入碱液以及等体积的非极性有机溶剂萃取，粗提物与碱液质量体积比例1g∶3～15ml；分离纯化：萃取8～16小时后，将有机层分离出来，将有机层旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200～300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为200‑800ml，用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集5‑15ml洗脱液，同时利用薄层色谱对样品瓶收集的洗脱液进行检测，当所用的洗脱液为环己烷‑乙酸乙酯v/v为8∶1时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷‑乙酸乙酯v/v为5∶1时，分别得到化合物3和6的粗品；环己烷‑乙酸乙酯v/v为2∶1时，分别得到化合物2、5和7的粗品；将这7个化合物的粗品分别置于凝胶柱上完成进一步的纯化，得到7个化合物的纯品；这7个化合物分别为：化合物1：3‑羟基‑2‑异丙基‑6‑甲基‑5‑(4‑甲基‑3‑氧戊基)萘化合物2：松香‑8，11，13‑三烯‑3β，12‑二醇化合物3：12‑松香羟基‑6，8，11，13‑四烯‑3‑酮化合物4：松香三烯基‑3β‑醇化合物5：11，12‑二羟基‑8，11，13‑松香三烯‑3，7‑二酮化合物6：11‑羟基‑12‑松香甲氧基‑8，11，13‑三烯‑3，7‑二酮化合物7：3β，11‑二羟基‑12‑松香甲氧基‑8，11，13‑三烯‑7‑酮所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；所述吸附剂为对萜类化合物具有较强的吸附能力并对细胞无毒的大孔吸附树脂，大孔吸附树脂为XAD‑7HP，XAD‑4，XAD‑1600或HP2MG；所述三尖杉培养细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加终浓度为0.1～2.5mg/L2，4‑二氯苯氧基乙酸，0.1～1mg/L激动素以及10～50g/L蔗糖，pH值为5.4～6.2；所述第二次提取时所用的碱液是指体积浓度为0。1～1％的氨水、质量浓度为0.05～0.5％的氢氧化钠或质量浓度为0.05～0.5％的氢氧化钾。