主权项 |
一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法,包括PCR反应,其特征在于下列步骤:1)采集牛源肉品试样,于‑20℃下保存备用;2)利用苯酚‑氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA;3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段,其引物序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列,该序列如序列表SEQ ID NO:1所示;5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应,对PCR反应产物进行电泳检测;6)在上述PCR反应的同时,设置阴性对照、阳性对照;7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定,若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,判定为样品中检测出普通牛源性成分,若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增,或扩增片段大小与预期片段大小不一致,判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分;其中:步骤5)所述的PCR反应的试剂如下:反应总体积:20.0μL;双蒸水:11.4μL;10×PCR缓冲液:2.0μL,室温,pH8.3‑9.0;延伸温度72℃;25mmol/L的氯化镁溶液:2.0μL,终浓度为2.5mmol/L;各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液:1.6μL;10μmol/L的SEQ ID NO:2所示的引物0.4μL,终浓度为0.2μmol/L;10μmol/L的SEQ ID NO:3所示的引物0.4μL,终浓度为0.2μmol/L;5U/μL的Taq DNA聚合酶:0.2μL,终浓度为0.05U/μL;20ng/μL的受检样品DNA模板:2.0μL,终浓度为2.0ng/μL;步骤5)的PCR反应程序如下:94℃预变性5min;94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸10s,30次循环;72℃延伸3min;步骤6)所述的阴性对照为非牛属动物水牛、绵羊或山羊,非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA;步骤6)所述的阳性对照为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA。 |