超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法

摘要

本发明提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法。通过检测与超氧阴离子作用前与作用后捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐含量的变化，分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子清除率以及检测、定量超氧阴离子含量。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到超氧阴离子清除剂筛选中，样品用量少、检测快速准确，线性方程相关系数达到0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，克服了电子自旋共振技术由于超氧阴离子寿命短而检测困难的问题，用于超氧阴离子清除剂筛选及超氧阴离子的检测、定量。

主权项

超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的超高效液相色谱是指：与高效液相色谱相比具有超高分离度、超高速度和超高灵敏度；所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物或单体；(1)超氧阴离子产生体系缓冲液的配制所用的超氧阴离子产生体系是黄嘌呤氧化酶‑黄嘌呤酶促反应体系，黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤产生超氧阴离子；超氧阴离子产生体系缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；(2)标准品的配制用水将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、3微摩尔/升、5微摩尔/升、7微摩尔/升或10微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲月替染料；(3)对照品、空白样品和样品的制备对照品的制备：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；空白样品的制备：总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤，加入终浓度25微摩尔/升的2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐，加入800微升的甲醇，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；样品的制备：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度为20微摩尔/升的超氧阴离子清除剂，终浓度100微摩尔/升的黄嘌呤，终浓度25微摩尔/升的2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测 对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱联用检测，从总离子流图中提取2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔/升至10微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐的线性方程：y＝ax+b式中，y为所述的标准品2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；①超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C182.1×50毫米1.7微米；流动相：A为甲醇，B为水；梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；流速：0.2毫升/分钟；进样量：5微升；②质谱条件质谱仪：Waters Xevo TQ；离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；毛细管电压：2000伏特；去溶剂气氮气温度：350摄氏度；去溶剂气氮气流速：800升/小时；锥孔气氮气流速：50升/小时；碰撞气氩气流速：0.15升/小时；第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5； 以上所述质谱条件在检测2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；锥孔电压在检测2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐时锥孔电压是20伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；碎裂能量和选择的碎片离子在检测2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐时碎裂能量是20，碎片离子是332.83；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30，碎片离子是124.08；对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；(5)超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率可以通过捕集剂2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐含量或产物水溶性甲月替染料含量的变化进行计算评价；分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐含量浓度，超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算：I样品＝(C样品‑C对照)/(C空白‑C对照)×100％式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；C样品为根据线性方程求得的样品中2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升；C对照为根据线性方程求得的对照品中2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐含量的浓度，量纲为微摩尔/升；C空白为根据线性方程求得的空白样品中2‑(4‑碘苯)‑3‑(4‑硝基苯)‑5‑(2，4‑二磺基苯)‑2H‑四氮唑钠盐含量浓度，量纲为微摩尔/升。