铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法

摘要

本发明公开了铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，包括以下步骤：(1)原球茎的诱导；(2)原球茎的液体悬浮培养增殖；(3)人工种子的制作；(4)人工种子的贮藏。与现有技术相比，本发明以液体悬浮培养(1/2MS培养基)增殖铁皮石斛原球茎，增殖效率较现有发明的固体培养基(MS培养基)增殖培养有显著提高，为人工种子生产提供了大量优质的人工种胚；本发明以海藻酸钠和硝酸钙溶液离子交换固化形成人工种皮，与现有发明的海藻酸钠和氯化钙溶液反应相比，制成的人工种子形状更规则、营养物质泄漏率较低；人工种子贮藏寿命延长，且发芽率较高。

主权项

一种铁皮石斛人工种子的制作和贮藏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原球茎的诱导：将铁皮石斛成熟但尚未开裂的蒴果在自来水下冲洗1‑2h，放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡0.5‑1min，无菌水冲洗3‑5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8‑10min，无菌水冲洗3‑5次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，用解剖刀将蒴果切开，将蒴果内种子均匀撒播在原球茎诱导培养基上，置于25℃人工气候箱中，先进行5d黑暗培养，然后转入光照培养，光照强度为2000lx，每日光照时间为16h，培养15d后种子萌发形成绿色的原球茎；原球茎诱导培养基组成为MS+0.5mg／L萘乙酸+30g／L蔗糖+10％土豆汁+0.5％活性炭+0.7％琼脂，pH5.8，培养基预先在121℃下高压灭菌15‑20min；(2)原球茎的液体悬浮培养增殖将诱导获得的铁皮石斛原球茎接种于液体增殖培养基中进行悬浮培养，每瓶装培养基25‑30ml，接种原球茎重量为1.5‑2.0g，将培养瓶置于25℃恒温摇床上振荡培养，转速为80‑100r／min，光照为自然漫射光，每培养15d更换一次培养液；原球茎液体增殖培养基配方为1／2MS+0.5mg／L萘乙酸+2.0mg／L6‑苄氨基嘌呤+30g／L蔗糖+0.1‑0.5g／L聚乙烯吡咯烷酮，pH5.8，其中1／2MS为大量元素减半的MS基本培养基；(3)人工种子的制作以MS+0.5mg／L萘乙酸+2.5mg/L6‑苄氨基嘌呤+30g／L蔗糖+0.3—0.4wt％多菌灵+0.2wt％活性炭+20mg／L脱落酸为人工胚乳，在其中加入3‑4wt％海藻酸钠熬制成半凝胶，经121℃高压灭菌20min后冷却备用，在超净工作台上，将经过30d液体悬浮增殖培养的大小为2‑4mm的铁皮石斛原球茎均匀悬浮于半凝胶中，用内直径为4mm的滴管吸取半凝胶和原球茎滴入已灭菌冷却的50—150mmol／L硝酸钙溶液中，保证每滴半凝胶中只含有一颗原球茎，经过20‑30min离子交换反应，倒去硝酸钙溶液，用无 菌水漂洗3次即可得到人工种子；(4)人工种子的贮藏在超净工作台上，将制得的人工种子置于无菌滤纸上吸干表面水分，再将其放入已灭菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。