一种稳定安全的嗜热链球菌活菌制剂及其制备方法

摘要

本发明涉及一种嗜热链球菌活菌制剂的生产方法，属于微生物技术领域，具体涉及一种嗜热链球菌微生态制剂的液体厌氧发酵生产方法。它包括以下步骤：采用嗜热链球菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为40~42℃的条件下培养16~20h，放罐并测定活菌数，用植物淀粉吸附发酵液并干燥，经过聚乙二醇PEG4000和聚丙烯酸钠处理之后，干燥、粉碎和包装，制成活性稳定的嗜热链球菌制剂。本发明的优点：用普通发酵罐即可完成嗜热链球菌的高密度发酵，操作简单，效果稳定，能耗低；不用离心机和冷冻干燥机等设备，降低了生产成本，提高了生产效率。

主权项

一种稳定安全的嗜热链球菌活菌制剂的制备方法包括以下步骤：    （1） 菌种活化：     本发明采用嗜热链球菌作为发酵菌种，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：1.6472，将‑80℃保存的嗜热链球菌活菌菌种在MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂粉 15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，菌种活化一般1~3次；    （2）制备一级种子：将活化的嗜热链球菌，用接种环挑取一环接种于20mL MRS液体（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养20小时左右，菌液以3%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养20小时左右备用；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；    （3）配制液体发酵培养基：经过优化后的嗜热链球菌液体发酵培养基配方：酵母膏7.5 g，蛋白胨7.5g，葡萄糖10 g，KH2PO4 2g，西红柿汁100 mL， Tween 80 0.5mL，蒸馏水900 mL，pH6.8，搅拌均匀，经121℃、20min高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl2 、MgSO4·7H2O及MnSO4·H2O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm；（4）液体发酵：将经过灭菌处理的液体发酵培养基按照3~5%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm，保持温度为40~42℃，pH 6.6‑6.8，培养16~20个小时放罐，将嗜热链球菌活菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度可达2.0~3.5×1010CFU/mL；（5）用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为发酵液的吸附剂，并将植物淀粉吸附的发酵液混合物进行烘干干燥；     （6）稳定化处理：       将烘干的嗜热链球菌活菌固体发酵培养物，加入质量比为0.25%的聚丙烯酸钠和5%的PEG4000（预先溶解于水），搅拌混匀，晾晒或者65℃下加温处理60min以内，经过干燥、粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。