一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

摘要

本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子-RBE元件-TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

主权项

一种含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒pCMV‑RBE‑TK1‑N2‑EF1α‑hFIXml，其特征在于该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因的筛选标记；所述RBE元件TK1基因的筛选标记序列采用常规分子生物学方法制备并插入pN2‑EF1α‑hFIXml质粒的位点Kpn I和Not I之间得到质粒pCMV‑RBE‑TK1‑N2‑EF1α‑hFIXml，其序列为SEQ.ID.NO5所示。