Verfahren zum spezifischen und quantitativen Nachweis von Antikörpern in einer Probe

摘要

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bildgebungsunabhängiges indirektes Immunfluoreszenzverfahren zur Quantifizierung der gegen rekombinant darstellbare Antigene gerichteten Antikörper in einer Probe. Das Verfahren basiert auf einem Parameter-spezifischen Substratpaar (Test- und Referenzsubstrat), welches sich jeweils von einer zur spezifischen Antigenproduktion induzierbaren Zelllinie ableitet und in einem gemeinsamen Inkubationsfeld mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Das Testsubstrat enthält Zellen, die zur rekombinanten Proteinproduktion induziert wurden und dient zur Quantifizierung der Bindung der gegen das rekombinante Antigen gerichteten Antikörper. Die Menge gebundener Antikörper wird beispielsweise durch die Verwendung eines gegen die zu detektierende Immunglobulinklasse gerichteten und mit einem Fluoreszenzfarbstoff 1 gekoppelten Zweitantikörpers im Fluoreszenzkanal 1 in einem Analysefenster A, welches mehrere Zellen umfasst, quantifiziert. Um die durchschnittliche Antikörperbindung pro Zelle im Analysefenster A zu ermitteln, wird durch die Fluoreszenzmarkierung eines von der rekombinanten Expression unbeeinflussten zellulären Markers wie beispielsweise der genomischen DNA eine Bezugsgröße im Fluoreszenzkanal 2 im Analysefenster A quantifiziert. Eine gleichartige Quantifizierung der zellnormierten Antikörperbindung gegen weitere im Substrat vorhandene nicht-rekombinante und im Sinne der Diagnostik als unspezifisch einzustufender Komponenten erfolgt mit Hilfe eines Referenzsubstrates im Analysefenster B, welches uninduzierte Zellen der gleichen Zelllinie enthält. Die Parameter-spezifische Antikörperbindung wird aus dem Verhältnis der Zellzahl-normierten Antikörperbindungen an Test- und Referenzsubstrat ermittelt. Durch die vorgeschlagene Bestimmung der in einer Patientenprobe enthaltenen Antikörpermenge auf der Grundlage zellulärer Substrate wird eine qualitativ hochwertige Diagnose des gesundheitlichen Zustands eines Patienten unabhängig vom Vorliegen funktionell aufreinigbarer Antigene ermöglicht.