一种鉴定蛋白质中半胱氨酸数量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定蛋白质中半胱氨酸数量的方法，特别是公开了一种鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸数量的方法。通过该方法可以快速、准确的鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基和等位基因的组成，并且能够确定每个高分子量谷蛋白亚基中含有的半胱氨酸残基的数目。本发明方法可应用于小麦品质改良和高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸残基数量的快速检测，从而发掘和筛选优质亚基，提高品质改良的效率。此外，本发明方法还可以对羽扇豆中盐溶蛋白和水溶蛋白中所含有的半胱氨酸残基数目进行鉴定，进而形成半胱氨酸残基数目鉴定的一套完整的技术体系。

主权项

一种鉴定待测蛋白中半胱氨酸残基数量的方法，是利用生物质谱方法根据用4‑乙烯吡啶处理和未用4‑乙烯吡啶处理的待测蛋白分子量的变化，确定待测蛋白中半胱氨酸残基的数量；所述待测蛋白来自小麦，所述待测蛋白的提取方法包括如下步骤：取15mg小麦面粉两份，两份都加入1ml体积百分含量为70%的乙醇，涡旋，离心，去上清；再分别加入体积百分含量为55%的异丙醇1ml，65℃水浴30min，去上清；再加入0.1ml含DTT的溶液A，DTT和溶液A质量百分比为1：100，其中溶液A的组成为，异丙醇：pH8的1M Tris‑HCl：双蒸水的体积比为50:8:42；涡旋混匀，65℃水浴30min，然后，12000g离心10min；第一份样品取上清，用40%体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；第二份样品加入0.1ml含4‑乙烯基吡啶的溶液A，4‑乙烯基吡啶和溶液A的体积百分比为1.4：98.6，涡旋混匀，65℃水浴30min；离心；取上清用40%体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都离心，弃上清，加入0.1ml含DTT的溶液A，DTT和溶液A质量百分比为1：100，65℃水浴30min；第一份样品取上清用40%体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；第二份样品再加入0.1ml含4‑乙烯基吡啶的溶液A，4‑乙烯基吡啶和溶液A的体积百分比为1.4：98.6，涡旋混匀，65℃水浴30min；离心；取上清用40%体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都离心，弃上清，干燥沉淀，加入70µl色谱级乙腈溶液，其中含有终浓度为0.1%的TFA，溶解4小时以上，将得到的上清液采用混合上样法进行质谱分析。