一种纯化包涵体蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种纯化包涵体蛋白质的方法，将包涵体蛋白质经IPTG诱导并在4℃离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块超声裂解、离心后，弃上清液，加入1Xbindbuffer重悬包涵体团块，超声裂解、离心，将该上清液加至Ni层析柱，流出液用3倍体积的1XBindbuffer洗涤柱床和3倍体积的Washbuffer洗涤柱床洗涤；依次加入含精氨酸的四种复性buffer至Ni层析柱,收集流出液；再加入Elutebuffer至Ni层析柱洗脱目标蛋白；取纯化的培养基上清液加至透析袋，用PBS于4℃透析2h，4℃离心15min沉淀目标蛋白。本发明方法快速、简便、有效地获得具有生物学活性的目标蛋白，降低了生产成本。

主权项

一种纯化包涵体蛋白质的方法，其步骤包括：将目的基因克隆入pET28a、pET44、pET32、 pWH1520或 pBAD表达载体中，经酶切、测序鉴定后，转化入表达菌株BL21(DE3)、Rosetta‑gami B(DE3) pLysS或Rosetta‑gami2 B pLysS中，加甘油‑80℃保存备用；取甘油保存的转化子在含抗生素卡那霉素、氨苄青霉素或链霉素的LB平板上划线，37℃培养箱过夜培养，挑单克隆，接种于5mL LB/抗生素培养基，37℃200rpm振荡培养至OD600为0.6，加1mM IPTG至上述菌液中继续培养，在1h、2h、12h三个时间点各取100μL菌液，离心后将上清液以TCA沉淀，细胞团块以2XSDS上样液溶解，上至SDS‑PAGE以检测目标蛋白表达，IPTG诱导过的细菌团块于‑80℃保存；取上述‑80℃保存的IPTG诱导过的细菌团块，加500μL 1× PBS，在冰上超声3次、每次15sec，间隔3min，再于4℃12000rpm离心15min，收集上清液，取10μL上清液和沉淀作SDS‑PAGE鉴定；根据鉴定结果扩大诱导规模至500mL，将大规模诱导的转化子在4℃离心，培养基上清液直接纯化；细胞团块加20mL由50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、10 mM咪唑、8 M尿素组成的 Bind buffer和200μL PMSF超声裂解5次，每次30sec、间隔3min，4℃离心20min，弃上清液，加入1X bind buffer重悬包涵体团块，超声裂解5次，每次30sec、间隔3min，4℃离心20min，将该上清液加至Ni层析柱；用3倍体积的1X Bind buffer洗涤柱床洗涤后，用3倍体积的由50 mM phosphate 8.0、 300 mM NaCl、20 mM咪唑、8 M尿素组成的Wash buffer洗涤柱床洗涤，再依次加入每种5 ml复性buffer至Ni层析柱, 收集流出液，加入5 ml由50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、250 mM咪唑组成的Elute buffer至Ni层析柱以洗脱目标蛋白，以0.5 x 10组份收集确定洗脱峰，取纯化的培养基上清液加至透析袋，在PBS中于4℃搅拌透析2h，4℃12000rpm离心15min沉淀目标蛋白；所述每种5 ml复性buffer次序为：    1）50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、20 mM咪唑、0.6 M精氨酸、4 M尿素，    2）50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、20 mM咪唑、0.6 M精氨酸、2 M尿素，    3）50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、20 mM咪唑、0.6 M精氨酸、1 M尿素，    4) 50 mM phosphate 8.0、300 mM NaCl、20 mM咪唑、0.6 M精氨酸、0.5 M尿素。