一种小麦组织活性氧荧光标记方法

摘要

本发明属于植物逆境胁迫与生理响应技术领域，特别涉及一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。该标记方法的步骤是：配制标记负载缓冲液、准备材料组织块、负载缓冲液漂洗组织块、在25℃下避光放置、用激光激发装置激发，观察并拍照。本发明的方法相对于传统的DAB、NBT等对活性氧种类的标记方法节省了时间，避免了样品长时间标记负载期间活性氧含量及部位的失真；可在DCFH-DA对活性氧标记的同时，对材料进行固定，保证活性氧标记的精确性；所用的器材要求简单，易于操作。

主权项

小麦组织活性氧荧光标记方法，包括下述的步骤：a. 配制小麦组织样品标记负载缓冲液，吸取小麦组织样品标记负载缓冲液5 ml置于器皿中；以上的样品标记负载缓冲液通过如下方法配制：配制10 mM Tris‑HCl或磷酸盐PBS缓冲液，其pH 7.2‑7.5；用DMSO、醇溶液配制浓度为3‑5 mM DCFH‑DA的母液；用缓冲液配制的荧光标记负载液，含最终浓度为30‑50 μM的DCFH‑DA、终浓度为50 mM的KCl和终浓度为2.2‑2.8%的戊二醛，其中戊二醛的浓度为体积百分比；b. 用刀片将小麦茎秆、叶片材料切成长度为0.4 ‑ 0.6cm组织块；c. 用样品标记负载缓冲液漂洗步骤b中的组织块，然后置于步骤a中盛有样品标记负载缓冲液的器皿中，密封后抽气；d. 在25℃下避光放置20‑30分钟；e. 将步骤d中的材料放置在显微镜载玻片上，用激光激发装置激发，在荧光显微镜下观察CCD图像采集系统拍照，显微镜工作条件为：激发波长为460‑500 nm，发散波长为510‑560 nm。